農桿菌介導亞洲百合轉化體系的建立及轉GsZFP1基因研究

張煥鄭佳闞丹丹樊金萍

（1.東北農業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030；2.伊春市南岔區(qū)人事局，153000 伊春；3.黑河市愛輝區(qū)紀檢委，黑河 164300）

農桿菌介導亞洲百合轉化體系的建立及轉GsZFP1基因研究

張煥1鄭佳2闞丹丹3樊金萍1

（1.東北農業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030；2.伊春市南岔區(qū)人事局，153000 伊春；3.黑河市愛輝區(qū)紀檢委，黑河 164300）

以亞洲百合‘耀眼’（Cedeazzle）無菌苗小鱗片為遺傳轉化受體，并利用農桿菌介導法將鋅指轉錄因子基因GsZFP1轉化‘耀眼’無菌苗小鱗片，初步建立亞洲百合‘耀眼’的遺傳轉化體系，通過篩選獲得了50株疑似轉化植株，通過用PCR方法對獲得的50株疑似抗性植株進行檢測，結果顯示20株呈陽性，PCR陽性轉化率為40%；將得到的陽性植株進行RT-PCR檢測，獲得12株RT-PCR陽性植株。結果表明，鋅指轉錄因子基因GsZFP1在亞洲百合‘耀眼’中得到表達。

亞洲百合 鱗片 轉化體系 農桿菌介導 GsZFP1基因

百合（Liliumspp.）是世界著名鮮切花，消費量逐年攀升［1］，并且百合在花卉市場上占有重要位置［2］。由于東北地區(qū)多以亞洲百合栽培為主，為了進一步提高亞洲百合的抗寒、抗旱性，因此開展將抗性基因導入百合的研究對百合抗性品種篩選具有重要的指導意義。而百合遺傳轉化體系多以直接再生方式為主［3］，遺傳轉化中多采用農桿菌介導法。如劉菊華等［4］以鱗片為受體，通過農桿菌介導法將攜帶有幾丁質酶基因和β-1，3葡聚糖酶基因導入百合，得到了轉基因植株。陳莉等［5］以麝香百合‘White Elegance’葉片為受體，將Mn-SOD基因導入百合中，以直接再生為主產生抗性植株。因此，通過農桿菌介導法將抗性基因導入百合的研究是必要的。

鋅指蛋白是目前發(fā)現(xiàn)種類最多、在真核細胞中具有重要調控作用的一類核酸結合蛋白［6］。它是一類具有指狀結構域的轉錄因子，普遍存在于植物中，主要功能涉及植物的生長發(fā)育和對環(huán)境脅迫的應答反應［7-9］。它對生物的發(fā)育及逆境脅迫的耐受能力都有著重要關系［10］。目前植物研究較多、較為明確的鋅指蛋白是C2H2型鋅指蛋白，該蛋白大部分鋅指結構具有一段高度保守的氨基酸序列 QALGGH，這是植物中獨有的特征［11］。研究表明，超量表達C2H2類型的ZFPs不但提高了植物對鹽、干旱及低溫等非生物脅迫的耐性，還同時改變了下游基因表達及脅迫響應信號通路的傳遞［12-15］。GsZFP1基因的表達產物屬于C2H2鋅指蛋白。GsZFP1基因是羅曉等［16，17］首次從野生大豆中克隆出來的，并且經研究表明，該基因能提高擬南芥植株的耐干旱、耐冷性。

本試驗用的植物表達載體pCEOM-GsZFP1帶有CaMV35S啟動子、E12增強子和 bar 篩選標記基因，CaMV35S啟動子是廣泛運用的組成型啟動子，在植物中表達效率高［18］，bar基因不僅可以作為篩選標記基因使用，還具有農藝價值且是國家公認的安全性基因［19］。本研究通過農桿菌介導法將GsZFP1基因導入亞洲百合‘耀眼’（Cedeazzle），期待提高其對干旱及冷的抗性，為今后培育亞洲百合抗性品種奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 亞洲百合‘耀眼’（Cedeazzle）鱗莖，由東北農業(yè)大學園藝試驗站溫室提供。

1.1.2 菌株和質粒 大腸桿菌菌株DH5α、農桿菌GV3101均由東北農業(yè)大學園藝學院園林育種實驗室提供；重組質粒pCEOM-GsZFP1由東北農業(yè)大學植物生物工程研究室提供。

1.1.3 常用試劑及酶類 DNA Marker DL2000、dNTPs、Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System均購自大連寶生物工程公司，PCR引物由哈爾濱博仕生物工程公司合成。

1.1.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 試驗各個階段所用的最佳培養(yǎng)基組成及其編號，見表1，各培養(yǎng)基中均含3.0% 蔗糖和 0.7% 瓊脂，pH為5.82，121℃滅菌 20 min；培養(yǎng)條件：溫度為（25±1）℃、光照強度為25 μmol（m2· s）、光照周期為16 h。

1.2 方法

1.2.1 質粒DNA的提取及檢測 采用中科瑞泰質粒小劑量提取試劑盒提取，提取重組質粒DNA后，進行PCR及凝膠電泳檢測。

1.2.2 凍融法轉化根癌農桿菌及檢測 采用凍融法將質粒pCEOM-GsZFP1轉入根癌農桿菌GV3101，先制備農桿菌GV3101感受態(tài)細胞，再將重組質粒轉入農桿菌感受態(tài)細胞中，最后進行檢測。

1.2.3 農桿菌介導亞洲百合‘耀眼’的遺傳轉化

1.2.3.1 轉化受體材料的獲得 剝取較厚大的亞洲百合‘耀眼’鱗片，先用流水沖洗40 min左右，再在超凈工作臺中經過一系列滅菌之后接種至M1培養(yǎng)基中，進行不定芽分化培養(yǎng)（圖1-A）；當不定芽長至3-5 cm時從基部切下，接種至M2培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)15 d，再取出置于組培室，進行試管鱗莖誘導培養(yǎng)（圖1-B），培養(yǎng)45 d左右時，取試管鱗莖上較厚大的小鱗片接種至M3培養(yǎng)基上，進行預培養(yǎng)，5 d左右時即可進行侵染（圖1-C）。

1.2.3.2 農桿菌侵染液的準備 先用接菌環(huán)挑取單菌落接種在10 mL含相應抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，于28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，至菌液OD600為0.5-0.6，約36 h；然后用接種環(huán)蘸取一次活化的菌液按1∶10的比例接種在50 mL添加相應抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中二次活化，于28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，至OD600為0.5-0.6，約16 h；最后將菌液移至無菌離心管中于10 000 r/min離心10 min，棄上清，用等體積的MS液體培養(yǎng)基重懸，再振蕩1-2 h，至OD600為0.5-0.6，即可作為侵染液備用。

1.2.3.3 篩選劑草丁磷（PPT）濃度的確定 選取試管鱗莖上生長厚大的小鱗莖，用刀片切成約0.25 cm2左右的小塊，在侵染液（OD600為0.5-0.6）中侵染20 min，接種在附加不同濃度PPT（0、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 mg/L）的分化培養(yǎng)基上，15 d繼代一次，30 d后觀察小鱗片不定芽分化情況；選取分化較好的不定芽從基部切下，接種在附加不同 濃 度PPT（0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mg/L）的生根培養(yǎng)基上，25 d后觀察生根情況。

1.2.3.4 抑菌劑頭孢霉素（Cef）濃度的確定 本試驗選用頭孢霉素（Cef）作為抑菌劑，用接種環(huán)把農桿菌GV3101在附加不同濃度Cef的YEB固體培養(yǎng)平板上劃線，放置在培養(yǎng)箱內進行28℃暗培養(yǎng)，2-3 d后觀察抑菌效果，初步確定抑菌劑的大致濃度。再進一步做外植體敏感性試驗。將轉化受體材料（小鱗片）在侵染液（OD600為0.5-0.6）中浸泡15-20 min，取出材料并用無菌濾紙吸干，接種到含有不同濃度（0、150、200、250、300、350、400 mg/L）Cef除菌篩選培養(yǎng)基上，15-20 d繼代一次，隨時觀察Cef的抑菌效果對小鱗片分化的影響，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計分化情況。

1.2.3.5 農桿菌最適侵染時間的確定 將外植體侵染時間設為5、10、15、20、25、30 min 6個梯度。用準備好的農桿菌侵染液侵染預培養(yǎng)5 d的‘耀眼’小鱗片，然后將其接種至M3培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)3 d左右時，取出接種至M4培養(yǎng)基上進行不定芽分化，培養(yǎng)一段時間后，將分化的不定芽從基部切下，接種至M5培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，觀察記錄其生長狀況。

1.2.4 轉基因植株的分子檢測

1.2.4.1 轉基因植株的PCR檢測 用CTAB法提取轉化后獲得的抗性植株葉片DNA，以葉片DNA為模板，以植物表達載體上Bar-35S啟動子序列特異引物進行PCR檢測。

1.2.4.2 PCR陽性植株的RT-PCR檢測 提取經PCR檢測陽性植株及非轉基因植株的總RNA，首先將其反轉錄，然后以反轉錄產物為模板，對轉GsZFP1基因陽性植株進行RT-PCR檢測，以檢測目的基因在轉錄水平上的表達。

2 結果

2.1 大腸桿菌質粒DNA的提取及檢測

提取重組質粒DNA后，進行PCR及凝膠電泳檢測，電泳結果（圖2）顯示，轉化質粒的陽性克隆擴增出目的條帶。

2.2 質粒DNA轉化根癌農桿菌及檢測

首先采用凍融法將重組質粒pCEOM-GsZFP1轉入農桿菌中，其次在含有相應抗生素的YEB培養(yǎng)基上劃線，待有單個的菌落長出后，進行搖菌，最后對得到的菌液進行PCR檢測。由電泳結果（圖3）可以看出，擴增出目的條帶，說明重組質粒已轉入到根癌農桿菌中，可以用于下一步的轉化。

2.3 農桿菌介導‘耀眼’的遺傳轉化

2.3.1 篩選劑草丁磷對外植體分化率的影響 經過不同濃度的草丁磷篩選試驗，30 d后觀察可知，小鱗片隨著草丁磷濃度的上升分化率明顯降低（圖4），統(tǒng)計數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)草丁磷濃度為1.0 mg/L時，‘耀眼’小鱗片的分化率明顯降低，為38.34%；草丁磷濃度為1.5 mg/L時，‘耀眼’小鱗片的分化率急劇下降，為8.34%；當草丁磷濃度為1.75 mg/L時，‘耀眼’小鱗片的分化率為3.33%，鱗片已經不能分化出健康的不定芽（表2）。因此，以鱗片作為轉基因受體分化不定芽時，篩選劑草丁磷濃度以1.75 mg/L為宜。

由表3可知，不定芽根的分化隨著草丁磷濃度的上升分化率明顯降低。統(tǒng)計數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)草丁磷濃度為0.75 mg/L時，根的分化率明顯降低，為36.67%；草丁磷濃度為1.0 mg/L時，根的分化率急劇下降，為17.50%；當草丁磷濃度為1.25 mg/L時，根的分化率為4.27%，不定芽已經不能分化出健康的根。因此，當轉基因不定芽分化根時，篩選劑草丁磷濃度以1.25 mg/L為宜。

2.3.2 抑菌劑頭孢霉素（Cef）濃度的確定 經初步篩選確定了抑菌劑的大概濃度為300 mg/L，然后在除菌篩選階段，以300 mg/L為基準再分別上下設定不同的濃度進行處理，1周后觀察效果（表4）。Cef 在300-350 mg/L范圍內能有效抑制農桿菌的生長，當Cef濃度為300 mg/L時，外植體的分化率為78.34%，相對較高；而當Cef濃度為350 mg/L時，外植體的分化率為41.67%，分化率相對較低。本著篩選不抑制植物生長的最大濃度的原則，確定‘耀眼’轉化抑菌劑濃度為300 mg/L。外植體不定芽長至3-5 cm 時，從基部切下，在300 mg/L濃度的抑菌劑溶液中沖洗一下，并用濾紙吸干，再接種至無菌苗生根培養(yǎng)基中。

2.3.3 農桿菌侵染時間對‘耀眼’轉化率的影響 由表5可知，侵染時間為5-10 min時，分化率較低；侵染時間為25-30 min時，褐化率較高，除菌較困難；侵染時間為.15-20 min時，外植體分化率較高，長勢較好，易除菌。其中侵染時間為20 min時，分化率最高且長勢好。因此，‘耀眼’無菌苗小鱗片最適宜的侵染時間為20 min。

2.3.4 亞洲百合‘耀眼’遺傳轉化以及抗性植株再生 農桿菌介導亞洲百合‘耀眼’轉化及抗性植株再生的過程如圖5所示，首先對預培養(yǎng)的小鱗片進行侵染（5-A）、預培養(yǎng)（5-B）；其次進行抗性芽的篩選（5-C）及芽伸長培養(yǎng)（5-D）；然后進行抗性苗的生根篩選（5-E，F(xiàn)）；最后進行移栽，獲得轉基因植株（5-G）。

2.4 ‘耀眼’轉基因植株的分子檢測

2.4.1 轉基因植株的PCR檢測 對篩選出的50株疑似抗性植株進行PCR檢測，用Bar-35S啟動子序列特異引物，以質粒為陽性對照，水為陰性對照，非轉基因植株為負對照對轉基因植株進行初步的篩選。經初步檢測，在試驗得到的50株疑似轉基因植株中，共得到20株PCR陽性植株，PCR陽性轉化率為40%，初步證明鋅指轉錄因子基因GsZFP1已轉入到亞洲百合‘耀眼’中。部分檢測結果見圖6。

2.4.2 陽性植株的RT-PCR檢測 為進一步檢測GsZFP1在轉基因植株中的表達情況，進行RT-PCR檢測。經檢測，篩選到的20株PCR陽性植株中，有12株為RT-PCR陽性植株，說明基因GsZFP1在這些植株中有成功轉錄的，但也有不轉錄的。部分檢測結果見圖7。

3 討論

由于本試驗所使用的植物表達載體pCEOMGsZFP1上帶有bar 篩選標記基因，因此選用草丁磷為篩選劑。在之前亞洲百合轉基因過程中，多數(shù)以卡那霉素及羧芐青霉素作為篩選劑，只有王凱等［20］在以亞洲百合‘金黃精靈’為受體材料，建立遺傳轉化體系的過程中，以草丁磷為篩選劑，并且得出芽分化階段PPT濃度為1.6 mg/L，根分化階段PPT濃度為0.8 mg/L。本研究通過篩選劑濃度梯度試驗確定亞洲百合‘耀眼’芽分化階段PPT最適的濃度為1.75 mg/L，根分化階段PPT最適的濃度為1.25 mg/L。試驗結果與前者不同，這說明亞洲百合不同品種在遺傳轉化的過程中，使用的篩選劑濃度也不同。

本試驗對篩選植株進行了PCR檢測和RT-PCR檢測，初步證明GsZFP1基因已在亞洲百合‘耀眼’表達，但對于轉基因‘耀眼’的抗旱性及耐冷性仍需進一步試驗研究，包括對轉基因植株進行基因表達水平的定量分析、基因表達對植株生理代謝的影響及遺傳穩(wěn)定性的表達等，以篩選出表達強、抗逆性提高幅度大且生長正常的轉基因植株，為以后百合的抗性育種和推廣應用奠定一定的理論基礎。

4 結論

本研究以亞洲百合‘耀眼’無菌苗小鱗片為轉化受體，以根癌農桿菌GV3103為轉化的菌株，bar基因為篩選標記基因，CaMV35S為啟動子，將GsZFP1基因導入亞洲百合‘耀眼’，建立亞洲百合‘耀眼’的遺傳轉化體系，通過篩選獲得了50株疑似轉化植株，用PCR方法對獲得的50株疑似抗性植株進行檢測，結果顯示20株呈陽性，PCR陽性轉化率為40%；將得到的陽性植株進行RT-PCR檢測，獲得12株RT-PCR陽性植株。結果表明鋅指轉錄因子基因GsZFP1在亞洲百合‘耀眼’中得到表達。

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（責任編輯 李楠）

Establishment of Agrobacterium-mediated Asiatic Lily‘Cedeazzle’Transformation System and Transfer of GsZFP1 Genes

Zhang Huan1Zheng Jia2Kan Dandan3Fan Jinping1
（1. College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030；2. Personnel，Nancha area，Yichun 153000；3. JiJianWei，Aihui District，Heihe 164300）

With small scales of aseptic seedling as genetic transformation, zinc finger transcription factor gene GsZFP1 was transformed into‘Cedeazzle’aseptic small scales by Agrobacterium-mediated, and the genetic transformation system of Asiatic Lily‘Cedeazzle’was established. Fifty putative transgenic plants were obtained, and 20 were identified as positive transgenic plants by PCR assay, PCR transform rate was 40%；and 12 positive plants were obtained by RT-PCR test. The results showed that GsZFP1 was expressed in Asiatic Lily‘Cedeazzle’.

Asiatic lily Small scales Transformation system Agrobacterium-mediated GsZFP1 gene

2013-08-23

張煥，女，碩士研究生，研究方向：園林植物遺傳育種；E-mail：ZHLQ8584@163.com

樊金萍，女，教授，研究方向：園林植物遺傳育種；E-mail：fan_xuer2000@aliyun.com