黃顙魚(yú)“裂頭病”病原二重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

隗黎麗吳華東劉毅

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南昌 330045；2. 江西師范大學(xué)生命學(xué)院，南昌 330022）

黃顙魚(yú)“裂頭病”病原二重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

隗黎麗1吳華東1劉毅2

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南昌 330045；2. 江西師范大學(xué)生命學(xué)院，南昌 330022）

“裂頭病”是黃顙魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的主要病害之一，其病原為鮰愛(ài)德華氏菌或遲鈍愛(ài)德華氏菌。以GenBank所收錄鮰愛(ài)德華氏菌與遲鈍愛(ài)德華氏菌16S rRNA基因?yàn)槟０澹瑑?yōu)化設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，經(jīng)多重PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及特異性與敏感性檢測(cè)，建立了檢測(cè)鮰愛(ài)德華氏菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的二重PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照樣品的瓊脂糖凝膠電泳條帶同時(shí)檢測(cè)到鮰愛(ài)德華氏菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為470 bp及268 bp，靈敏度為1.38 ng/μL。此法用于檢測(cè)江西南昌地區(qū)多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)所患“裂頭病”黃顙魚(yú)腦部DNA，11份患病黃顙魚(yú)的腦部組織均檢出鮰愛(ài)德華氏菌，表明該地區(qū)黃顙魚(yú)所患“裂頭病”的病原菌為鮰愛(ài)德華氏菌，此結(jié)果與常規(guī)細(xì)菌分離鑒定的檢測(cè)結(jié)果一致。所建二重PCR檢測(cè)法敏感度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)成本低，對(duì)黃顙魚(yú)“裂頭病”的快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查有較好的應(yīng)用價(jià)值。

黃顙魚(yú) 裂頭病 鮰愛(ài)德華氏菌 遲鈍愛(ài)德華氏菌 二重PCR

黃顙魚(yú)（Pelteobagrus fulvidraco）因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，已成為一種名貴的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。近些年來(lái)，在養(yǎng)殖黃顙魚(yú)中流行一種 “裂頭病”或“紅頭病”的疾病，主要表現(xiàn)為頭頂穿孔，頭蓋骨開(kāi)裂，甚至露出腦組織。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)患病黃顙魚(yú)病原研究發(fā)現(xiàn)，不同養(yǎng)殖區(qū)域的黃顙魚(yú)病原不同，可能為遲鈍愛(ài)德華氏菌［1，2］或鮰愛(ài)德華氏菌［3-5］。目前，對(duì)黃顙魚(yú)的“裂頭病”病原的檢測(cè)主要采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離方法，而傳統(tǒng)的生理生化檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力（需要7 d左右），且操作復(fù)雜，敏感性較低。常規(guī)PCR反應(yīng)一次只能檢測(cè)一種致病菌種，而目前可使黃顙魚(yú)發(fā)病的致病菌的可能為鮰愛(ài)德華氏菌或遲鈍愛(ài)德華氏菌菌，這就可能需要多次檢測(cè)才能確定致病菌，使得檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)，檢測(cè)費(fèi)用增加，延誤治療。針對(duì)這種情況，在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展了多重PCR技術(shù)，目前已建立起針對(duì)兩種或多種致病菌的多重PCR檢測(cè)技術(shù)［6-11］。多重PCR技術(shù)是在同一PCR體系中加入多對(duì)引物，對(duì)多個(gè)目的基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增的分子生物學(xué)方法，可同時(shí)檢測(cè)多種病原體或多個(gè)基因型，從而達(dá)到對(duì)多種疾病的同步診斷，縮短檢測(cè)的時(shí)間［12］。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)不同區(qū)域養(yǎng)殖黃顙魚(yú)“裂頭病”病原菌的快速檢測(cè)和監(jiān)控，本試驗(yàn)探討建立二重PCR技術(shù)，一次性檢測(cè)鮰愛(ài)德華氏菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌，以期為黃顙魚(yú)愛(ài)德華菌病提供一種快速準(zhǔn)確、高效經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

柱狀黃桿菌，中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所魚(yú)類(lèi)免疫學(xué)學(xué)科組饋贈(zèng)，該菌的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基配方參考文獻(xiàn)［13］的方法。鮰愛(ài)德華氏菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌均為本實(shí)驗(yàn)室分離株，金黃色葡萄球菌來(lái)自于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。其中，鮰愛(ài)德華氏菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌分別采用腦心浸（BHI）液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h，嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌采用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24 h。2×TaqPCR MasterMix購(gòu)買(mǎi)于天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker DL1000購(gòu)買(mǎi)于大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖和細(xì)菌DNA基因組抽提試劑盒購(gòu)買(mǎi)于全式金生物技術(shù)有限公司；多重PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 二重PCR引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的遲鈍愛(ài)德華氏菌和鮰愛(ài)德華氏菌的16S rRNA基因序列（序列號(hào)分別為AY626368和AB100170），同時(shí)參考文獻(xiàn)［9］，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)特異性PCR引物，序列見(jiàn)表1。

1.2.2 細(xì)菌DNA提取 細(xì)菌DNA基因組按全式金細(xì)菌DNA基因組抽提試劑盒的說(shuō)明書(shū)要求提取，紫外分光光度計(jì)測(cè)定模板DNA的濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 二重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 將兩種菌的DNA模板等量混合后，對(duì)影響二重PCR反應(yīng)效果的引物濃度、退火溫度以及2×TaqPCR Master濃度進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件。

1.2.4 引物特異性的驗(yàn)證 從柱狀黃桿菌、金黃色鏈球菌、嗜水氣單胞、鮰愛(ài)德華氏菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌中提取DNA模板，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)引物特異性。

1.2.5 二重PCR靈敏度的測(cè)定 將兩種目標(biāo)菌株分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，采用試劑盒提取DNA模板，檢測(cè)二重PCR方法的靈敏度，紫外分光光度計(jì)測(cè)定模板DNA的濃度。然后將模板進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)瑱z測(cè)二重PCR的靈敏度。

1.2.6 二重PCR方法對(duì)黃顙魚(yú)腦組織的檢測(cè) 對(duì)2012年7月至9月在江西南昌蔣巷和毛蓮湖的11份臨床疑似病料進(jìn)行檢測(cè)，11份疑似病料的病理癥狀均出現(xiàn)不同程度的頭頂充血、出血、發(fā)紅，顱骨頂部皮膚潰爛，鰭條基部出血，肛門(mén)及生殖孔充血、出血、外突等特征（圖1）。將疑似病料的腦組織，用全式金DNA基因組抽提試劑盒進(jìn)行DNA的抽提，根據(jù)說(shuō)明書(shū)的具體步驟進(jìn)行操作，然后采用二重PCR方法檢測(cè)所抽提的DNA模板。

2 結(jié)果

2.1 二重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 引物濃度的優(yōu)化 先將鮰愛(ài)德華氏菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌正反向引物（10 μmol/mL）等體積混合，在15 mL PCR反應(yīng)體系中，添加混合引物0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 μL進(jìn)行二重PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖2）顯示，不同濃度的引物均可以擴(kuò)增出條帶，條帶明亮清晰，條帶之間互不干擾，無(wú)拖尾，但當(dāng)引物濃度增加到0.4 μL時(shí)，就可見(jiàn)二聚體產(chǎn)生，隨后，引物濃度越大，二聚體越明顯，非特異性擴(kuò)增條帶亮度明顯增加。因此，最適引物添加量為0.2 μL。

2.1.2 2×TaqPCR Master濃度的優(yōu)化 使用的是2×TaqPCR Master，15 μL反應(yīng)體系中其添加量依次為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5 μL。擴(kuò)增結(jié)果（圖3）顯示，2×TaqPCR Master添加量為7.5 μL時(shí)擴(kuò)增的條帶效果最為理想。

2.1.3 退火溫度的優(yōu)化 為了摸索最佳的退火溫度，依次設(shè)置了53、54、55和56℃作為退火溫度。結(jié)果（圖4）顯示，退火溫度在55℃時(shí)條帶明亮清楚，無(wú)非特異性擴(kuò)增。

2.1.4 二重PCR反應(yīng)條件的確定 在相同反應(yīng)條件下，本著條帶較亮、二聚體較少、試劑用量較少的原則，確定反應(yīng)條件。即在15 μL反應(yīng)體系中，鮰愛(ài)德華氏菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌上下游引物用量分別為0.1 μL，2×TaqPCR Master 7.5 μL，ddH2O 6.3 μL，鮰愛(ài)德華氏菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌的cDNA模板用量為0.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察，擴(kuò)增條帶見(jiàn)圖5。

2.2 二重PCR的引物特異性

提取柱狀黃桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌的DNA，用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增（圖6），顯示為陰性。

2.3 二重PCR反應(yīng)的靈敏度

分別用紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提取的鮰愛(ài)德華氏菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌DNA的濃度，將其等濃度混合，其終濃度為1.38 ng/μL；將混合的DNA 10倍稀釋?zhuān)M(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果（圖7）顯示，濃度為138、13.8和1.38 ng/μL的稀釋模板可以擴(kuò)增出目的條帶，即該P(yáng)CR方法可檢測(cè)的最低的DNA的量為1.38 ng。

2.4 二重PCR對(duì)患病黃顙魚(yú)腦組織DNA的檢測(cè)

通過(guò)對(duì)2013年7月在南昌市附近不同黃顙魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)采集的11份患病黃顙魚(yú)腦組織樣本進(jìn)行二重PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示（圖8）在11份患病黃顙魚(yú)的腦組織中均檢出了鮰愛(ài)德華氏菌。

3 討論

影響二重PCR反應(yīng)效果的因素較多，其中引物設(shè)計(jì)的好壞直接關(guān)系到PCR 擴(kuò)增的特異性和成功與否。其次還需要通過(guò)調(diào)整優(yōu)化二重PCR反應(yīng)體系和條件參數(shù)以使多重PCR 檢測(cè)效果得到最佳。本試驗(yàn)中遲鈍愛(ài)德華氏菌和鮰愛(ài)德華氏菌引物濃度在0.07-0.24 μmol/mL（添加體積為0.2-0.7 μL）之間擴(kuò)增都可以出現(xiàn)條帶。但以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且看增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。因此，確定最優(yōu)化的引物濃度為0.1 μmol/L，即15 μL PCR反應(yīng)體系中遲鈍愛(ài)德華氏菌和鮰愛(ài)德華氏菌引物的添加體積分別為0.1 μL。

二重PCR反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)，不同反應(yīng)之間對(duì)TaqDNA聚合酶存在競(jìng)爭(zhēng)，將會(huì)使效率相對(duì)較低的DNA擴(kuò)增受到抑制。在二重PCR體系中加入適量TaqDNA聚合酶可以減弱抑制作用。本研究中使用的是2×TaqPCR Master擴(kuò)增試劑盒，該試劑盒包含TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)的增強(qiáng)劑和優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑、濃度為2×。具有快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可最大限度的減少人為誤差。

為了降低成本和尋找最佳的反應(yīng)濃度，本試驗(yàn)設(shè)置了不同的15 μL反應(yīng)體系2×TaqPCR Master添加量分別為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5 μL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均能擴(kuò)增出條帶，但是濃度太低，條帶則不亮，而濃度太高，又發(fā)現(xiàn)有非特異性擴(kuò)增，因此，在15 μL PCR反應(yīng)體系中2×TaqPCR Master的添加量為7.5 μL。

退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量，退火溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降，退火溫度低，PCR反應(yīng)的產(chǎn)量提高，但過(guò)低可造成引物與模板錯(cuò)配，易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。本試驗(yàn)中，設(shè)置了53、54、55和56℃ 4個(gè)退火溫度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了56℃擴(kuò)增時(shí)，條帶不明顯外，其他均能擴(kuò)增出條帶，但綜合考慮，用55℃擴(kuò)增時(shí)，條帶穩(wěn)定性強(qiáng)，可獲得很好的擴(kuò)增效果。

通過(guò)對(duì)患病黃顙魚(yú)腦組織樣本進(jìn)行二重PCR檢測(cè)，結(jié)果均檢出了鮰愛(ài)德華氏菌，這與我們采用傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定的方法（已投稿）檢測(cè)的結(jié)果相符。此外，本試驗(yàn)的靈敏度達(dá)到了1.38 ng/μL，顯示該方法是很靈敏的。因此該技術(shù)不但可以用于對(duì)該病的診斷，而且還可以用于帶菌魚(yú)的診斷。

4 結(jié)論

本研究建立的二重PCR方法操作簡(jiǎn)單，快速，具有很好的特異性，能夠準(zhǔn)確鑒定和區(qū)分鮰愛(ài)德華氏菌和遲鈍愛(ài)德華氏菌兩種菌，可以應(yīng)用于臨床樣品中鮰愛(ài)德華氏菌或遲鈍愛(ài)德華氏菌的單個(gè)或混合感染的檢測(cè)。

［1］ 鄧先余, 羅文, 譚樹(shù)華, 等.黃顙魚(yú)（Pelteobagrus fulvidraco）“紅頭病”病原菌遲鈍愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）的分離及鑒定［J］.海洋與湖沼, 2008, 39（9）：511-516.

［2］ 陳飛鵬.黃顙魚(yú)“裂頭病”病原、病理及同工酶研究［D］.保定： 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

［3］ 徐進(jìn), 羅曉松, 曾令兵.黃顙魚(yú)鯰愛(ài)德華氏茵的分離鑒定及其致病性研究［J］.淡水漁業(yè), 2009, 39（6）：47-53.

［4］ 鄭善堅(jiān).黃顙魚(yú)紅頭病病原研究［J］.水產(chǎn)科學(xué), 2009, （12）：757-759.

［5］ 耿毅, 汪開(kāi)毓, 范方玲, 等.養(yǎng)殖黃顙魚(yú)（Pelteobagrus fulvidraco）鮰愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）的分離鑒定與生物學(xué)特性研究［J］.海洋與湖沼, 2010, 41（1）：61-67.

［6］ 王遠(yuǎn)微, 湯承, 于學(xué)輝, 等.三重PCR 檢測(cè)魚(yú)類(lèi)致病性是嗜水氣單胞菌［J］.微生物學(xué)報(bào), 2008, 48（7）：947-951.

［7］ 祝璟琳, 王國(guó)良, 金珊.養(yǎng)殖大黃魚(yú)病原弧菌多重PCR檢測(cè)技術(shù)的建立和應(yīng)用［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2009, 16（2）：156-164.

［8］ Panangala VS, Shoemaker CA, van Santen VL, et al. Multiplex-PCR for simultaneous detection of 3 bacterial fish pathogens, Flavobacterium columnare, Edwardsiella ictaluri, and Aeromonas hydrophila［J］. Diseases of Aquatic Organisms, 2007, 74：199-208.

［9］ Sakai T, Yuasa K, Sano M, Lida T. Identification of Edwardsiella ictaluri and E.tarda by species-specific polymerase chain reaction targeted to the upstream region of the fimbrial gene［J］. Journal of Aquatic Animal Health, 2009, 21：124-132.

［10］ 范萬(wàn)紅, 劉葒, 呂建強(qiáng), 等. 蛙病毒屬 PCR檢測(cè)方法的建立及其在甲魚(yú)“紅脖子”病原鑒定中的應(yīng)用［J］. 檢驗(yàn)檢疫科學(xué), 2007, 17（1-2）：6-9.

［11］ 鄧顯文, 謝芝勛, 劉加波, 等. PCR檢測(cè)診斷羅非魚(yú)熒光假單胞菌病技術(shù)的建立［J］. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 7：126-128.

［12］ Ogawa H, Taira O, Hirai T, et al. Multiplex PCR and multiplex RTPCR for inclusive detection of major swine DNA and RNA viruses in pigs with multiple infections［J］. J Virol Methods, 2009, 160：210-214.

［13］ 王良發(fā), 謝海俠, 張金, 等. 我國(guó)淡水魚(yú)類(lèi)柱形病原菌柱狀黃桿菌的遺傳多樣性［J］. 水生生物學(xué)報(bào), 2010, 34（2）：367-377.

（責(zé)任編輯 李楠）

Establishment and Application of Duplex PCR to the Pathogen of“Cracked Head” from Yellow Catfish（Pelteobagrus fulvidraco）

Wei Lili1Wu Huadong1Liu Yi2
（1. College of Animal Science and Technology，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045；2. College of Life Sciences，Jiangxi Normal University，Nanchang 330022）

“Cracked head disease” is one of the major diseases in cultured yellow catfish（Pelteobagrus fulvidraco）. In this study, two special oligonucleotide primers for duplex PCR amplication were designed to detect the pathogen of“cracked head disease”from yellow catfish（Pelteobagrus fulvidraco）. The reaction conditions of the duplex PCR were optimized and PCR products were sequenced. Specificity and sensitivity of duplex PCR were studied. Finally, the duplex PCR is well developed successfully allowing the detection of the two bacterial pathogens in one PCR tube with relatively equal intensities DAN bands when analyzed in an agarose gel. The result showed the expected DNA fragments of 470 bp and 268 bp were observed, respectively. The sensitivity of duplex PCR was 1.38 ng/μL. When it was applied to detect the bacterial in brain of fish which were naturally infected in Nanchang, Jiangxi Province, Edwardsiella ictaluri was detected in 11 diseased samples of yellow catfish. The result was coherence with that of traditional technology of physiology and biochemistry, which showed that the duplex PCR could be used not only to diagnose the diseased yellow catfish but also to monitor the fish infected by bacteria. It can be concluded that the duplex PCR is specific and sensitive. It is a reliable tool for identification of the Edwardsiellosis with less time and cost, and it can be used in quick diagnose and epidemiology investigation of bacterial of “Cracked head disease” from yellow catfish.

Yellow catfish Cracked head disease Edwardsiella ictaluri Edwardsiella tarda Duplex PCR

2013-09-24

江西省科技廳項(xiàng)目（20114BAB214002，20111BBF60021，20121BBF60034）

隗黎麗，女，講師，博士，研究方向：魚(yú)類(lèi)免疫學(xué)的教學(xué)與研究；E-mail：hbliliwei@163.com

劉毅，男，副教授，博士，研究方向：魚(yú)類(lèi)免疫學(xué)的教學(xué)與研究；E-mail：yiliusan@sina.cm