GlnR介導(dǎo)的代謝調(diào)控研究進(jìn)展

江 湖， 田 健， 應(yīng) 碧， 伍寧豐?， 徐 波?

1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌330045；

2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

細(xì)菌代謝的有效性和適應(yīng)性是眾所周知的。它們進(jìn)化出復(fù)雜且連鎖的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以應(yīng)對幾乎任何環(huán)境條件。為了能快速恰當(dāng)?shù)刈鞒鲰憫?yīng)，細(xì)菌必須緊密監(jiān)測必要營養(yǎng)的可利用性，如碳源、氮源、磷、硫、微量元素、陽離子和陰離子。細(xì)菌通過監(jiān)測這些營養(yǎng)物質(zhì)的胞外濃度、胞內(nèi)累積，以及胞內(nèi)的流動，把這些信號傳遞到調(diào)控蛋白從而作出響應(yīng)［1］。

在很多革蘭氏陽性細(xì)菌的基因組中，都存在glnR基因，其編碼的蛋白GlnR是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。GlnR最初是在天藍(lán)鏈霉菌中被鑒定，它能使谷氨酰胺營養(yǎng)缺陷型回復(fù)成野生型［2］。研究證實，GlnR不僅在氮代謝的調(diào)控中扮演重要角色，也與磷酸代謝、抗生素合成等次級代謝途徑以及細(xì)菌毒性存在交叉調(diào)控［3～6］。 目前，已有大量針對GlnR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研究。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在很多菌屬中（如枯草芽胞桿菌、擬無枝酸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、天藍(lán)色鏈霉菌和恥垢分枝桿菌等），GlnR是氮代謝調(diào)控的一個全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它對很多參與氮代謝的基因都有調(diào)控作用。氮代謝途徑的相關(guān)基因中，glnA、gdhA、glnPQ、amtB、nirBD、ureA、glnK 和 glnD 等均受GlnR 的調(diào)控［7～9］。

1 GlnR在不同細(xì)菌氮代謝調(diào)控中的作用

氮源是細(xì)菌生存最重要的元素之一，其中對氮源的有效吸收和同化是所有細(xì)菌生存最重要的能力。細(xì)菌進(jìn)化出許多機(jī)制吸收各種各樣的氮源［9］。氮源的同化與吸收和無機(jī)氮源摻入細(xì)胞代謝物，是幾乎所有細(xì)菌的重要生理過程。不同氮源經(jīng)過同化，形成了細(xì)胞內(nèi)重要氮素來源的兩種氨基酸，即谷氨酰胺和谷氨酸。銨幾乎總是首選氮源，因為它能直接被同化成生物合成反應(yīng)的關(guān)鍵氮素，即谷氨酰胺和谷氨酸。細(xì)菌存在兩條銨同化途徑：谷氨酸脫氫酶（GDH）途徑和谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶（GS/GOGAT）途徑［10，11］。 谷氨酰胺合成酶（GS）是氮代謝調(diào)控中的關(guān)鍵酶，其活力受到嚴(yán)格的調(diào)控，以保證谷氨酰胺的供應(yīng)不會受到細(xì)胞可利用氮源的影響。

有關(guān)細(xì)菌氮代謝調(diào)控研究最初是在腸桿菌（Enterobacteriaceae）中進(jìn)行的，并以此作為原核生物氮源調(diào)控的模式菌株，目前對枯草芽胞桿菌和鏈霉菌屬的氮代謝調(diào)控研究也較為清晰。大部分微生物的氮代謝具有一個共同之處，即都是由一個全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白介導(dǎo)，GlnR就是這樣一個全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。GlnR屬于螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋OmpR家族蛋白。但在革蘭氏陰性腸桿菌中并不存在GlnR同源物，它們可以通過雙元件系統(tǒng)調(diào)控谷氨酰胺合成酶的翻譯，并通過可逆共價修飾調(diào)節(jié)谷氨酰胺合成酶的酶活［12］。同樣在革蘭氏陽性梭菌屬中也未發(fā)現(xiàn)GlnR，它們通過反義RNA調(diào)節(jié)谷氨酰胺合成酶的水平［12，13］。因此也顯示出微生物的氮代謝調(diào)節(jié)機(jī)制存在很大差異。

1.1 枯草芽胞桿菌中GlnR參與的氮代謝調(diào)控

枯草芽胞桿菌B.subtilis是低G+C含量革蘭氏陽性菌最突出的模式菌株，其中至少存在3個調(diào)控蛋白CodY、GlnR和TnrA調(diào)控氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)［15］。GlnR和TnrA是MerR家族轉(zhuǎn)錄因子的主要成員，能識別相同的操作子序列5′?TGT?NAN7TNACA?3′［16～19］。

枯草芽胞桿菌沒有谷氨酸脫氫酶活性，只能通過谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶途徑吸收銨?？莶菅堪麠U菌的谷氨酰胺合成酶活力受反饋調(diào)節(jié)（feed back inhibited GS， FBI?GS），glnR 直接位于glnA上游，是雙順反子glnRA操縱子的一部分，GlnR具有一個α-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域，形成二聚體并結(jié)合到glnRA操縱子的操作子glnRA01和glnRA02上，在氮源豐富時抑制 glnRA的轉(zhuǎn)錄［18，19］。 氮源貧乏時（如谷氨酸作為唯一氮源），glnRA操縱子的表達(dá)被TnrA抑制。氮源豐富時，GlnR也能抑制脲酶操縱子ureABC、tnrA基因以及幾個受TnrA調(diào)控的基因的表達(dá)。TnrA和GlnR不僅調(diào)控了自身的表達(dá)，還彼此相互調(diào)節(jié)［20］。GlnR通過與谷氨酰胺合成酶相互作用，間接感應(yīng)谷氨酰胺濃度，調(diào)節(jié)自身活性。盡管 GlnR和TnrA識別相同的序列，但GlnR不能調(diào)控某些TnrA的靶基因，這可能是由于GlnR對包含兩個GlnR/TnrA識別位點的 DNA有較高的親和性［11，19］。

1.2 放線菌中GlnR參與的氮代謝調(diào)控

放線菌能產(chǎn)生大量具有重要生物活性的次級代謝產(chǎn)物，是商業(yè)酶和藥物的生產(chǎn)菌。GlnR在放線菌氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控中起著重要作用，包括天藍(lán)鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）［21］、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（S.venezuelae）［22］、地中海擬無枝酸桿菌（Amycolatopsis mediterranei）［23］、恥垢分枝桿菌（ Mycobacterium smegmatis）［7，24］、 戈 登 氏 菌（Gordonia）［25］和人源肺結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosis）［26］。

天藍(lán)鏈霉菌是產(chǎn)抗生素鏈霉菌屬的模式菌，與枯草芽胞桿菌不同的是，它的 GlnR是屬于OmpR家族的轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)菌雙組分系統(tǒng)典型的應(yīng)答調(diào)控蛋白，不能調(diào)控自身的表達(dá)，據(jù)推測GlnR活性受一個未知的組氨酸激酶的磷酸化作用調(diào)節(jié)。氮源受限時，GlnR能激活天藍(lán)鏈霉菌銨同化相關(guān)基因的表達(dá)，包括分別編碼谷氨酰胺合成酶同工酶 GSⅠ?β和 GSⅡ的 glnA和 glnⅡ基因，以及編碼氨轉(zhuǎn)運蛋白的amtB基因。天藍(lán)鏈霉菌還存在一個與GlnR很相似的OmpR家族調(diào)控蛋白GlnRⅡ，與glnⅡ相鄰，GlnRⅡ能與glnⅡ上游序列相互作用。GlnRⅡ能識別大部分GlnR的靶標(biāo)基因，glnR的缺失導(dǎo)致天藍(lán)鏈霉菌的谷氨酰胺營養(yǎng)缺陷型，而glnRⅡ缺失突變株仍能在不含谷氨酰胺的最低限度培養(yǎng)基生長，GlnRⅡ在氮代謝中的作用目前還不清楚［27，28］。 Tiffer等［29］通過生物信息學(xué)手段搜尋包含相同GlnR結(jié)合序列的啟動子，結(jié)合體外實驗，在天藍(lán)鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)10個新的GlnR靶標(biāo)，包括硝酸、尿素等多種氮源同化的基因和一些功能未知的基因。有趣的是，GlnR對其中一些靶標(biāo)基因也有負(fù)調(diào)控作用，包括gdhA、ureA和其他一些功能未知的基因。最近，研究發(fā)現(xiàn)天藍(lán)鏈霉菌中的硝酸鹽還原酶編碼基因nasA及硝酸鹽同化相關(guān)基因nnar也受到GlnR的調(diào)控，但 GlnR識別序列與之前發(fā)現(xiàn)的稍有不同［27，30～32］。

分枝桿菌中，GlnR類似蛋白可以激活amt1基因、amtB?glnK?glnD 操縱子和 glnA 基因的表達(dá)，氮源受限時抑制亞硝酸鹽還原酶基因nirB的表達(dá)。

1.3 乳酸乳球菌中GlnR參與的氮代謝調(diào)控

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是低G+C含量革蘭氏陽性菌的模式菌株之一，由于具有多種氨基酸營養(yǎng)缺陷型［33］，關(guān)于其谷氨酰胺和谷氨酸代謝調(diào)控研究相對較少，因此對其氮代謝了解并不多。

Larsen等［34］通過構(gòu)建乳酸乳球菌glnR缺失突變株結(jié)合DNA微陣列的方法，在乳酸乳球菌中發(fā)現(xiàn)了10個GlnR靶標(biāo)，其中包括3個直接靶標(biāo)glnRA操縱子、推定的銨轉(zhuǎn)運及感應(yīng)操縱子amtB?glnK和谷氨酰胺/谷氨酸ABC轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因glnPQ。乳酸乳球菌 glnR缺失突變株中 glnA、amtB?glnK操縱子的表達(dá)被高度抑制，amtB?glnK啟動子-35區(qū)上游的GlnR盒對GlnR介導(dǎo)的抑制作用極為重要。

在乳酸乳球菌中，GlnR和另外一個全局調(diào)控蛋白CodY在氮代謝調(diào)控中均起重要作用，在氮源豐富時CodY可能接管GlnR對amtB?glnK的調(diào)控。乳酸乳球菌的GlnR識別與枯草芽胞桿菌的GlnR/TnrA相同的轉(zhuǎn)錄操縱子序列，但二者只有一個共同的GlnR靶標(biāo)，即glnRA操縱子，而乳酸乳球菌中受GlnR調(diào)控的glnPQ基因在枯草芽胞桿菌中受 TnrA 調(diào)控［7，18，19］。 因此，盡管乳酸乳球菌和枯草芽胞桿菌中的GlnR功能相似，但乳酸乳球菌的GlnR具有不同于枯草芽胞桿菌的氮代謝調(diào)控方式。

1.4 致病菌中GlnR參與的氮代謝調(diào)控

低G+C含量革蘭氏陽性致病菌肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）中，GlnR 識別并結(jié)合與枯草芽胞桿菌相同的保守的操縱子序列，調(diào)控glnRA和glnPQ?zwf操縱子及谷氨酸合成酶編碼基因gdhA的表達(dá)，GlnR的調(diào)控依賴于谷氨酰合成酶［33～36］。 Schreier等［5］通過回補(bǔ)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的glnR到枯草芽胞桿菌glnR缺失突變株，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的GlnR與枯草芽胞桿菌GlnR有相似的功能，推測金黃色葡萄球菌中氮代謝基因同樣受到類似的GlnR介導(dǎo)的調(diào)控作用。

2 GlnR與細(xì)菌其他代謝途徑的交叉調(diào)控

GlnR不僅參與細(xì)菌的氮代謝調(diào)控，同時也與細(xì)菌的多種代謝途徑存在交叉調(diào)控。

2.1 與次級代謝的交叉調(diào)控

天藍(lán)鏈霉菌的雙組份系統(tǒng)AfsQ1/Q2是抗生素合成和形態(tài)分化的一個多效性調(diào)節(jié)子［4］。AfsQ1/Q2通過直接激活途徑特異性基因actⅡ?ORF4、redZ和 cdaR的表達(dá)，刺激放線菌紫素（actinorhodin，ACT）、十一烷基靈菌紅素（undecyl?prodigiosin，RED）和鈣依賴抗生素（calcium?de?pendent antibiotic，CDA）的合成。 AfsQ1/Q2 同時也是氮源同化的阻遏物，抑制GlnR靶標(biāo)glnA、amtB和ureA的表達(dá)，并且可以與GlnR競爭結(jié)合glnA和nirB的啟動子，而GlnR也可以與actⅡ?ORF4、redZ和cdaR基因各自的啟動子結(jié)合，說明AfsQ1/Q2和 GlnR在氮代謝中存在交互調(diào)控作用。

Yu 等［23，37］發(fā)現(xiàn)地中海擬無枝酸桿菌在沒有硝酸鹽存在時，GlnR抑制利福霉素（rifamycin）的合成。將地中海擬無枝酸桿菌的glnR轉(zhuǎn)入親緣關(guān)系較近的天藍(lán)鏈霉菌，研究表明GlnR廣泛參與到宿主菌的次級代謝調(diào)控。因此，地中海擬無枝酸桿菌中，GlnR是氮代謝和相關(guān)抗生素合成的雙功能調(diào)控蛋白。

2.2 與磷代謝的交叉調(diào)控

PhoR/P是磷酸代謝的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，磷酸受限時，PhoP可以直接抑制glnR及GlnR靶標(biāo)基因 glnA、glnⅡ和 amtB的轉(zhuǎn)錄。PhoR/P介導(dǎo)的磷酸代謝調(diào)控和GlnR介導(dǎo)的氮代謝調(diào)控也存在交叉調(diào)控［3，38～40］，GlnR 的調(diào)控作用已經(jīng)超出初級氮代謝。

2.3 與其他代謝途徑的交叉調(diào)控

2.3.1 嘌呤降解途徑 氮源受限時，枯草芽胞桿菌可以啟動嘌呤降解途徑以獲得充足氮源，脲酶操縱子ureABC的激活保證嘌呤被徹底降解成銨［41］。 Jaclyn 等［42］首次發(fā)現(xiàn)在枯草芽胞桿菌中，脲酶操縱子的表達(dá)同時受到GlnR介導(dǎo)的調(diào)控和嘌呤轉(zhuǎn)運降解途徑酶的調(diào)控。在枯草芽胞桿菌中，GlnR的抑制作用還依賴于谷氨酰胺合成酶的反饋抑制作用，F(xiàn)BI?GS可以激活GlnR與DNA的結(jié)合并穩(wěn)定 GlnR?DNA 復(fù)合物［43］。

2.3.2 戊糖磷酸途徑 Kloosterman 等［35］發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性致病菌肺炎鏈球菌中，GlnR抑制戊糖磷酸途徑代謝酶Zwf編碼基因的表達(dá)。GlnR的調(diào)控作用依賴于GlnA，并且glnA和glnP缺失突變株對Detroit 562人類咽喉上皮細(xì)胞粘著性顯著降低，表明這些基因影響了肺炎鏈球菌在宿主中的定殖。這也間接證明GlnR在肺炎鏈球菌毒性發(fā)揮中扮演著重要角色。

2.3.3 耐酸性應(yīng)激效應(yīng) 鏈球菌突變株的一個主要毒性特征就是其具有耐酸性應(yīng)激效應(yīng)（acid tolerance response，ATR）。citB基因編碼的蛋白酶參與檸檬酸代謝途徑中催化丙酮酸轉(zhuǎn)化成α?酮戊二酸的反應(yīng)，α?酮戊二酸為谷氨酸和谷氨酰胺提供碳骨架。Chen等［44］發(fā)現(xiàn)中性pH條件下，citB的表達(dá)被GlnR抑制，酸性處理30min后，這種抑制作用更為明顯。酸性處理45min后，GlnR缺失突變株的存活率比野生型低10倍以上，回補(bǔ)后突變株的存活率恢復(fù)到和野生型一樣，表明鏈球菌突變株的最佳耐酸性應(yīng)激效應(yīng)需要GlnR。

3 展望

革蘭氏陰性腸桿菌中不存在GlnR，由雙組分系統(tǒng)調(diào)控谷氨胺合成酶的轉(zhuǎn)錄，并通過可逆共價修飾調(diào)節(jié)谷氨酰胺合成酶的活性。腸桿菌中氮代謝調(diào)控研究，為革蘭氏陽性細(xì)菌中GlnR介導(dǎo)的氮代謝調(diào)控研究作出重要的貢獻(xiàn)。高通量技術(shù)的應(yīng)用，如蛋白質(zhì)組技術(shù)、DNA芯片技術(shù)等，為理清全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的復(fù)雜關(guān)系提供了有效手段。隨著更多細(xì)菌基因組測序的完成，結(jié)合強(qiáng)有力的生物信息學(xué)預(yù)測手段，越來越多的GlnR靶標(biāo)被發(fā)現(xiàn)，其中不乏間接靶標(biāo)，但是GlnR對這些靶標(biāo)基因的間接調(diào)控作用有待于進(jìn)一步的研究。天藍(lán)鏈霉菌中，新GlnR結(jié)合順式作用元件的發(fā)現(xiàn)［29］，也為搜尋GlnR靶標(biāo)基因提供了新的思路。深入研究GlnR在其他代謝途徑中的作用，對進(jìn)一步闡述GlnR參與次級代謝活性產(chǎn)物、細(xì)菌形態(tài)分化和細(xì)菌毒性等的調(diào)控具有重要的意義。此外，過去幾年，雖然幾個菌屬中GlnR的調(diào)控模式已經(jīng)研究得更加詳細(xì)，但調(diào)控GlnR活性的信號和機(jī)制目前還不是很清楚，亟須更深入的研究。

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