類過氧化物DNA酶在生物傳感器領域的研究進展

李森,王源升,2，余紅偉,李瑜

1.海軍工程大學 理學院化學與材料系，湖北 武漢 430033；2.四川大學 高分子材料工程國家重點實驗室，四川 成都 610065

具有催化功能的DNA被稱為DNA酶（DNA?zyme）或脫氧核酶。眾所周知，DNA酶可催化很多反應，包括DNA或RNA的分裂[1-2]、DNA的修飾、共價連接[3-4]、卟啉環(huán)的金屬化作用等。DNA酶的催化特性已被用于醫(yī)療和生物傳感等領域。

用DNA酶代替辣根過氧化物酶（HRP）構筑電化學生物傳感器，可以結合DNA酶及電化學檢測的優(yōu)點，使其具有獨特性能。與傳統(tǒng)酶相比，DNA酶價格低廉、穩(wěn)定，可在較寬的酸度和溫度范圍使用。

在工業(yè)、生物、環(huán)境、臨床診斷和食品分析等領域，H2O2的測定具有重要意義。多種以HRP或酶-媒介體修飾的電化學傳感器已用于H2O2測定[5]。已有許多利用該類DNA酶催化H2O2氧化的報道，但多數(shù)集中在比色法[6-7]、熒光[8]和化學發(fā)光法[9]的傳感研究方面。

DNA分子另一個活躍的應用領域出現(xiàn)在20年前，就是通過適配體識別分子。核酸序列可以有選擇地結合目標分子[10]。適配體和DNA酶結合產生了功能核酸，這種組合允許用于檢測任何被選定的適配體發(fā)現(xiàn)的目標分子。

DNA酶的顯著優(yōu)勢刺激了本領域的研究。最近受關注的DNA酶是具有類過氧化酶活性的脫氧核酸酶[11]。本文將關注具有類過氧化物活性的DNA酶在生物分析領域的應用。

1 類過氧化物DNA酶的特性

擁有過氧化物酶活性的DNA酶是在20世紀90年代晚期被Sen等首先報道的[12]。他們注意到酶所包含的氯化血紅素作為顯示過氧化物酶活性的輔助因子，并且即便不含脫輔酶，氯化血紅素也可將過氧化物酶反應催化到一定程度。人們開始尋找一種能夠增加氯化血紅素催化活性的人工系統(tǒng)。

G-四鏈體是由富含鳥嘌呤堿基（G）的DNA或RNA序列形成的一種特殊的核酸二級結構[8]。G-四鏈體DNA酶則是由G-四鏈體與氯化血紅素結合后形成的具有過氧化物酶活性的DNA酶[13]。與一些天然的過氧化物酶相比，G-四鏈體DNA酶具有價廉、易于制備儲存、易于修飾及水解穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性好等優(yōu)勢。近年來，利用這類DNA酶，已設計了多種化學及生物傳感器，包括核酸傳感器、金屬離子傳感器及適配體傳感器等。

最早報道的能夠增強氯化血紅素催化H2O2活性的形成四重折疊結構的序列是一種叫做PS5.M的24核苷酸適體。另一種PS2.M是比PS5.M縮短6個核苷酸的相似體，對卟啉的粘結和對H2O2的催化都展現(xiàn)出更強的作用[8]。

Shangguan等[14]注意到G-四鏈體和DNA酶催化活性的關系，這和粘結氯化血紅素的能力息息相關。有著平行鏈的四分子結構展現(xiàn)出低過氧化物酶活性，且單分子逆平行的四折疊結構表現(xiàn)出較低的酶作用。據觀察，有最強活性的是平行或混合型的分子內四折疊結構[15]。G-四鏈體的布局也會受到并列陽離子類型、G-4平面數(shù)量和環(huán)狀物組織的影響。

陽離子的存在對于四折疊結構的形成是必需的。早期研究表明，鉀離子對于四折疊結構的形成和催化活性是必需的。然而，近期的報道顯示其他的離子也可以被利用，并且在一些情況下，用銨離子取代鉀離子會更有效地促進酶的活性。Nakayama和Sintim[5]注意到了銨離子的存在降低了寡核苷酸氧化降解的危險。

為了觀察DNA酶的活性，需要進行一個合適的指示劑反應。雙氧水存在時，ABTS的氧化會產生有色產物，并且吸收光譜的變化會被用于監(jiān)測反應進程。發(fā)光氨和雙氧水的反應會產生化學發(fā)光，其強度可被視為催化信號。對于和ABTS的反應，Shen等[16]發(fā)現(xiàn)添加ATP會對酶的活性產生積極作用。ATP隱藏了ABTS·+的不均衡，讓ABTS成為類過氧化物酶反應的良好基底[17]。Wang等[18]的研究表明過氧化物酶的活性依賴于雙氧水而不是基底濃度。這個結論顯示了DNA酶與HRP相比所不同的反應機理：活性隨著ABTS的濃度而增強。在DNA酶催化的反應中，氧從雙氧水轉移到Fe（Ⅲ）是一個速率受限的步驟，下一步（包含ABTS氧化）的速率并不影響總體反應速率[18]。

2 在檢測領域的應用

2.1 DNA檢測

類過氧化物DNA酶活性在DNA檢測中已經有了很多應用[9,19]。DNA檢測都是建立在DNA雜交的基礎上的。人們提出了許多利用脫氧核酶進行DNA檢測的不同方法。

Willner等[9]報道了一種用于目標DNA檢測的化學發(fā)光方法。生物化學發(fā)光一般采用酶激活化學發(fā)光。DNA樣品與探針雜交后，與化學發(fā)光底物酶結合，隨即加入化學發(fā)光底物，由于化學發(fā)光底物酶可激活底物發(fā)光，便可通過探測化學發(fā)光強度得知分子雜交情況。與部分目標DNA互補的寡核苷酸探針A被添加在金電極表面。報道DNA鏈（B）由2部分組成，一個負責催化活性（G-四鏈體），另一個可以黏接到目標DNA的互補區(qū)域。目標DNA與酶標記的報道鏈雜交，被金表面的寡核苷酸探針捕獲，被后來添加的發(fā)光氨和雙氧水追蹤，產生發(fā)光信號。

在另一個應用中，同一個研究團隊以一個催化分子信標作為雜交探針用于DNA探測[19]。分子信標是一段與特定核酸互補的DNA探針，空間結構上呈發(fā)夾結構，包含能產生G-四鏈體的A、B片段，A片段是與靶DNA互補的探針，由于發(fā)夾結構包含了莖環(huán)雜交片段B，不能形成DNA酶。當DNA分析物存在時，就可以和發(fā)夾環(huán)雜交，導致發(fā)夾打開，釋放片段B，當存在氯化血紅素時就會產生DNA酶。把ABTS和雙氧水加入溶液中就會產生比色度讀數(shù)。

金納米顆粒的應用也被報道過[20]。有一個片段部分互補于分析DNA的硫化核酸探針，被固定于金電極表面。探針有能力去捕捉目標DNA，且目標DNA的未雜交部分可以和攜帶DNA鏈段的納米金顆粒相互作用，DNA鏈由限制在與目標DNA互補的片段上的DNA酶組成。因為每個納米金顆粒都攜帶了許多DNA酶單元，導致金電極表面的納米金顆粒的雜交和催化信號顯著放大。經過表面的清洗，添加雙氧水和發(fā)光氨，就會觀察到發(fā)光作用。

四折疊結構也能由2條DNA鏈形成，Willner等用這種方法建立了一個DNA傳感器[21]。這些兩兩的寡核苷酸形成DNA酶片段，且能攜帶互補于DNA分析物的序列。如果目標DNA與2條鏈一起雜交，四折疊結構就不能形成，也不會檢測到信號。不含目標DNA的控制實驗包含與氯化血紅素形成DNA酶，并且加入發(fā)光氨和雙氧水會產生發(fā)光信號。

Mao等[22]提出了一個新穎的兩步信號放大法進行DNA探測，第一步涉及蛋白酶，第二步涉及DNA酶。DNA分析物作為滾環(huán)擴增反應的引子，產生了一個能形成DNA酶的重復序列線性鏈段。在該方法中，用作RCA反應的環(huán)狀模板包含2個片段，一部分互補于分析物，另一部分互補于四折疊結構。當存在dNTPS時，DNA聚合酶拉長了被模板雜交的目標DNA鏈，產生了許多DNA酶結合域。下一步，加入氯化血紅素會導致活潑的脫氧核酶的形成，氧化ABTS并給出發(fā)光信號。該方法利用了雙倍放大，考慮到目標DNA在pmol/L濃度水平，其中許多DNA酶結合域由單個目標DNA酶產生，并且每個DNA酶隨后氧化了許多DNA酶結合域。

Willner等[23]介紹了一種全新、復雜的基于自組裝核酸結構和DNA酶串聯(lián)反應的雜交試驗。這個結構包含了3條核酸鏈。分子A和B對于DNA分析物部分互補，但也擁有允許它們黏接在準循環(huán)DNA（C）上的序列；核酸C包含1個核糖堿基（rA）和2個能夠形成四折疊結構的片段。當一個DNA分析物出現(xiàn)時，所有的部分會被連接成一個超分子結構。這個結構包含2個環(huán)狀物，產生了一個以rA做基質的依賴鎂離子的DNA酶。加入鎂離子后，出現(xiàn)了DNA分裂，并且釋放能夠形成四折疊結構的序列。隨后和氯化血紅素復合，再利用ABTS氧化的比色分析法進行目標DNA的檢測。

Willner等提出了另一個用于DNA放大檢測的獨立方法[24]。該試驗通過發(fā)卡結構和分析物的雜交，形成了一個能夠被FOKI核酸內切酶識別的位點。由于核酸內切酶的活性，這個結構不對稱地分裂了，釋放了一個能形成類過氧化物酶的DNA酶序列。加入氯化血紅素、雙氧水和發(fā)光氨后，脫氧核酶催化這個反應，并產生了一個發(fā)光信號。除了DNA酶，分裂過程產生了其他2個產物。一條鏈不能用于隨后的反應，另一條鏈是形成類過氧化物DNA酶的反應催化劑。催化劑和另一個發(fā)卡結構黏接在一起，提供了一個用于FOKI的新的黏接位點。這個過程可以反復地產生類過氧化物DNA酶、廢品和催化劑。這個試驗也可被用于其他DNA序列，這些序列包含適合產生FOKI結合位點的堿基域。

DNA酶已被用于檢測致病微生物的DNA，如沙門菌、分支桿菌等[25]。Mahesh等開發(fā)了兩步法用于這方面的分析。第一步包括一個不對稱的PCR反應，第二步利用分析序列的雜交，這個序列帶有兩半由一段與目標DNA互補的序列所連接的分裂DNA酶。雜交之后，兩半的DNA酶序列形成了一個四折疊結構，且結合了氯化血紅素獲得了類過氧物酶的活性。只有目標DNA和探針雜交，使用不對稱的PCR技術使互補DNA分子得到排出，才能消除和DNA鏈段之間的相互作用。從細菌提取物中得到的DNA分析物，在70次循環(huán)中以10 μL的反應量得到放大，通過對PCR產物的視覺檢測從而得到評定。

2.2 金屬離子檢測

G-四鏈體的形成是一個依賴金屬離子的過程，因此，人們對使用DNA酶的金屬離子檢測充滿了興趣[26-28]。Wang等提出DNA酶催化活性是由鉀離子有選擇地引發(fā)的。他們?yōu)榱俗C明鉀離子選擇性的假設，以TMB作為DNA酶活性指示劑和其他離子進行了相當數(shù)量的試驗。TMB氧化時形成了2個產物，一個顯示藍色，用強酸結束反應后形成了另一個黃色產物。這個反應使鉀離子能夠被裸眼觀察到。該實驗也被用于現(xiàn)實樣品中鉀離子的確定，比如血清。然而，Nakayama等[29]報道，G-四鏈體在銨離子存在時比鉀離子能夠展現(xiàn)出更強的催化活性。這些矛盾的結論顯示了四折疊結構和指示劑反應在DNA酶的金屬陽離子選擇上的重要性。

人們探索了許多確定鉛元素的試驗方法，問題在于是否能在一個低于指定水平的濃度監(jiān)測有毒金屬。Dong等[28,30]進行了一個類過氧化物DNA酶為指示劑標記的檢測鉛離子的試驗。他們注意到鉛離子導致了鉀離子四鏈結構的重排，并且導致四折疊結構不能顯示催化活性。DNA酶催化活性的減弱和加入鉀離子樣品中鉛離子的濃度大小是相對應的。DNA酶被鉛離子影響而產生變構規(guī)律，其具體表現(xiàn)就像一種抑制物，并且把DNA酶的活性模式轉變?yōu)榉腔钚浴＿@種方法顯示催化核酸不僅能像蛋白酶一樣顯示催化活性，也可以受到規(guī)律機理的支配。

另外一個對環(huán)境和人類健康產生危害的污染物是汞。為了檢測環(huán)境中的汞離子，人們開發(fā)了許多傳感器，包括類過氧化物DNA酶。已經應用的有2種，并且都是基于2個胸腺嘧啶與汞離子結合形成一個T-Hg+-T復合物[18,31]。此結合也被用于將單鏈DNA折疊成雙鏈DNA，加強DNA雙鏈結構[32]，激活DNA酶。

Wang等[18]設計了允許汞的比色度檢驗降低到50 nmol/L的方法。他們利用富含胸腺嘧啶殘基的寡核苷酸，這些胸腺嘧啶能形成有催化活性的四折疊結構，存在鉀和氯化血紅素時，就形成了DNA酶，加入雙氧水和ABTS后能夠觀察到催化活性。加入汞離子后破壞四折疊結構，并且抑制酶活性的THg2+-T堿基對形成。

Shen等提出了一個不同的方法，就是利用THg+-T堿基對檢測汞離子[31]。這是一種在汞離子存在的情況下檢測催化活性的“打開”傳感器。含胸腺嘧啶的殘留物中被加入寡核苷酸的5′端，這些寡核苷酸可形成分子間的四折疊結構。由于在汞離子存在的情況下形成了T-T堿基對，四鏈體的折疊變得容易，并且催化活性效率也增加了。此方法對汞離子的檢測限是19 nmol/L。

Shen等[33]提出了一個實驗，用類過氧化物DNA酶檢測銀離子。類似汞離子，銀離子可以和核苷酸形成復合物。當銀離子存在時，就會形成C-Ag+-C堿基對。特定的結合是設計寡核苷酸的基礎，這些寡核苷酸在銀離子的影響下可以折疊成四折疊結構。這個方法用ABTS氧化的色度指標反應。利用該方法可以測定濃度低于20 nmol/L的銀離子。

Xie等[34]提出了一種用作銅（Ⅱ）比色檢測的變構雙DNA酶的單分子探針。此測定法利用由3個片段組成的寡核苷酸。第一域（A）是用作DNA裂解活性的脫氧核酶的基底，中域包含一段能形成四折疊結構和展示過氧化物酶活性的序列，第三域包含一個依賴銅離子的DNA裂解脫氧核酶。當沒有銅離子時，DNA裂解脫氧核酶被激活，并且裂解了DNA基底。由于釋放了中域，活躍的類過氧化物酶脫氧核酶形成。吸光度的變化（從與H2O2反應的TMB得到的）與銅離子濃度成正比。這種方法的靈敏度是1 μmol/L銅離子。

2.3 DNA酶與適配體組成適體傳感器

適體傳感器是能對低分子量基底或蛋白質顯示特定黏結性的DNA或RNA分子[35]。通過在體外篩選和PCR技術擴增，這些分子可以相對容易地獲得。適配體在傳感應用中可被作為適體傳感器。在適配體-DNA酶結合物中，適配體是一個識別元件，而脫氧核酶產生解析信號。由于二者都是DNA寡核苷酸，因此很容易獲得二者的結合物。由于這些優(yōu)勢，使其成為解析AMP和可卡因等小分子的特定、靈敏的工具[36]。這些結合后的DNA探針被稱為變構適體傳感器。

我們提出了一種基于DNA酶的適配體無標記檢測腺苷的方法，所設計的適配體DNA序列內包含2個功能域：一個是配體結合域，用于對特定目標物的響應；一個是酶催化元件，在合適條件下催化特定的反應體系產生可檢測的信號。沒有特定配體時，催化元件由于不合適的結構折疊而不具有酶功能，引入配體使適體產生適當折疊，發(fā)卡結構打開，加入氯化血紅素，引起特定的DNA序列產生構象變化，與氯化血紅素形成具有催化功能的G-4螺旋結構，對底物體系產生催化作用，產生電化學信號。

Willner等[35]提出了一個用于AMP檢測的基于DNA酶的適配體。在適體和AMP的復合物形成后，脫氧核酶給出了一個比色信號。該方法可以檢測濃度低至4 μmol/L的AMP。核酸擁有2個片段，A代表一段AMP適配體序列，B富含鳥嘌呤堿基，并且在氯化血紅素存在時形成具有過氧化物酶活性的DNA酶。核酸探針被阻斷劑雜交，它有一段序列和片段A和B互補。適配體-AMP復合物的形成引起阻斷劑和探針核酸之間雜交的解離，鏈段B被釋放，并可以與顯示類過氧化物酶活性的氯化血紅素形成一個四折疊結構配合物。阻斷劑-核酸雙螺旋結構的去雜交只有在AMP分子出現(xiàn)時才能發(fā)生。

Willner也提出了另一種替代方法，用于沒有阻斷劑分子時AMP的探測[37]。該核酸探針包含2個域，分別是AMP和可卡因的適配體。根據不同的目的，AMP或可卡因都能被這個適配體傳感器檢測出來。信標核酸包括2個域，能夠與適體序列雜交，其中一個域在氯化血紅素的存在下可折疊成具有過氧化物酶活性的脫氧核酶。靶分子與相應的適配體的結合導致了由探針和信標寡核苷酸形成的雙螺旋體的去雜交。加入氯化血紅素、H2O2和ABTS后，就會觀測到吸光度的變化。這個傳感器可以檢測低至5 μmol/L的AMP和低至0.1 μmol/L的可卡因。

Deng提出了另一個適配體檢測腺苷的方法[38]。通過合并一個腺苷適配體和裂成兩半的類過氧化物DNA酶，可以獲得一個變構傳感器。鏈段1，一個58鏈節(jié)的寡核苷酸，由3個域（A、B和C）組成。片段A可以和包含片段D的鏈2雜交。域B是捕獲腺苷的適體。片段C和D在氯化血紅素存在時可形成活性脫氧核酶。在沒有目標分子的情況下，域B具有足夠的靈活性，允許片段C和D形成G-四鏈體。然而，當存在腺苷時，域B采用特定結合目標分子的二次結構，DNA酶的兩半相隔很遠，以至于二者不能雜交成一個G-四折疊結構。腺苷的存在導致吸光度的下降與被分析物的濃度成正比。用本適體傳感器，腺苷可在6 μmol/L的水平得到檢測。

許多使用脫氧核酶的分析系統(tǒng)被用來檢測凝血酶。TBA（凝血酶結合適體）是一個15鏈節(jié)的寡核苷酸，能結合G-四鏈結構的凝血酶。在鉀離子存在時，它可以作為具有過氧化物酶活性的DNA酶。該復合物通過H2O2催化ABTS的氧化。Dong等[39]報道了基于脫氧核酶的凝血酶傳感器，檢出限為20 nmol/L，這種脫氧核酶也可用于測定其他蛋白質[7]。核仁蛋白是人類癌癥細胞的蛋白質標記，DNA寡核苷酸AGRO100是該蛋白的適配體。適體-蛋白質復合物的形成，抑制了DNA的復制和細胞增殖，AGRO100可用于抗癌治療。能夠抑制HIV-1整合酶的G-四鏈體適配體的研究也在進行中。適配體T30695和93del顯示了過氧化物酶活性，并可被用于HIV-1和整合酶的檢測[7]。

2.4 單核苷酸多態(tài)性檢測

單核苷酸多態(tài)性（SNP）在基因組DNA變異中是最常見的類型。SNP最重要的應用是診斷遺傳性疾病。SNP分析的重要性導致測定數(shù)量的顯著發(fā)展。這些方法都基于雜交、酶活性測量或其他復雜的反應，大多數(shù)情況下非常耗時。Kolpashchikov等以過氧化物酶脫氧核酶作為信號探針[40]，發(fā)現(xiàn)SNP可能會影響阿爾茨海默癥患病的風險。與DNA分析物部分互補的寡核苷酸被分成兩部分，并且與能夠形成脫氧核酶的許多半序列通過三甘醇連接子連接起來。在有DNA分析物存在的情況下，它們和探針雜交，并且DNA酶序列的兩半足夠近以形成一個四折疊結構，加入氯化血紅素和雙氧水后還要經歷基底的氧化作用。DNA酶的過氧化物酶活性對于一個帶有SNP的DNA分子的系統(tǒng)來說是相對低的，并且可與在沒有任何靶DNA時的活性相媲美。

2.5 其他應用

Yao等用具有過氧化物酶活性的脫氧核酶檢測其他分子的酶活性。他們公布了檢測甲基轉移酶和抗氧化劑的實驗結果。甲基轉移酶催化DNA的甲基化，這在基因表達調制中是一個非常重要的過程。研究已表明，不正確的DNA甲基化是一種癌癥生物標志物，這使得甲基轉移酶成為抗癌治療的一個潛在目標。轉移酶活性檢測的多數(shù)方法是費時且昂貴的，或需要放射性標記。為了克服這些缺點，Yao等提出了一個針對甲基轉移酶活性的DNA酶試驗[41]。發(fā)夾脫氧核酶探針由能夠形成核酶和轉移酶活性識別位點的序列組成。在沒有轉移酶的情況下，發(fā)夾結構可以防止活性脫氧核酶的形成。在測定溶液中，甲基轉移酶和核酸內切酶（DpnⅠ）都存在。核酸內切酶切割了探針DNA的甲基化位點，因此，能夠形成過氧化物酶活性的脫氧核酶序列被分離，并且氧化ABTS使比色讀出。這個方法使甲基轉移酶活性的檢測限低至6 U/mL。

自由基反應引起重要細胞成分，如DNA、蛋白質或脂類的降解。抗氧化劑可防止自由基所造成的損害，因此，監(jiān)測活生物體中的抗氧化劑的活性很有必要。通常采用的方法（ESR、熒光標記）具有較低的敏感性，且價格昂貴，耗費人力。使用脫氧核酶則更便宜方便，并具有良好的靈敏度[42]。在氯化血紅素的存在下，能夠形成四鏈體的序列顯示類過氧化物酶活性，導致ABTS的氧化。在供氫體的存在下，抗氧化劑可以捕捉氧化分子并使其回到初級狀態(tài)。吸光度讀數(shù)的減少正比于所分析的樣品中抗氧化劑的活性。

3 結語

在各種不同的生物分析中，具有類過氧化物酶活性的脫氧核酶得到了廣泛應用。良好的熱穩(wěn)定性、易于結合適配體，使其成為各種蛋白質跟蹤分析傳感系統(tǒng)的理想選擇。大多數(shù)傳感器通過緩沖溶液中的模型分析物進行開發(fā)和測試[43-44]。對于實際診斷和環(huán)境監(jiān)測，應對基質效應進行排查。因此，需要更多的研究來優(yōu)化感知系統(tǒng)，消除基質效應。

大部分生物傳感器系統(tǒng)采用了PS2.M被選擇的序列，因為其較強的過氧化物酶活性，該序列能在體外進行篩選。然而，能夠形成G-四鏈結構的富含鳥嘌呤的基因組序列還有很多例子。因此，人們期望這樣一個序列生成的脫氧核酶可以表現(xiàn)出類過氧化物酶的活性。這種端粒酶活性的測定方法最近有報導[45]。弱的催化活性已被用于人類端粒G-四鏈體的存在下生產的端粒酶的TMB底物氧化。

另一方面，目前大多數(shù)方法是基于使用數(shù)量非常有限基底的比色度讀數(shù)。為了提高以脫氧核酶為基礎的傳感器設計的靈活性，需要新的信號傳導策略。這種嘗試最近已由Nakayama等[46]報道。作者確定了幾種酚和以熒光素作為熒光底物的衍生物，可以在氯化血紅素-G-四鏈體的復合物存在時被氧化成熒光產物。鑒于熒光法的眾多優(yōu)點，如良好的靈敏度、寬動態(tài)范圍、多信號檢測選項（熒光強度、各向異性和壽命熒光能量共振轉移），現(xiàn)在需要對新的熒光底物展開探索。

考慮到放大檢測的巨大潛力、良好的選擇性和傳感系統(tǒng)的良好操作性，可以預料基于脫氧核酶的傳感器將會獲得持續(xù)快速的發(fā)展和進步。

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