分子標(biāo)記在煙草性狀連鎖基因定位中的應(yīng)用進(jìn)展

羅昭標(biāo)，陳歡，毛華，占資撫，王木榮

1.撫州市煙草公司 資溪分公司，江西 撫州 335300；2.南昌工學(xué)院 民族教育學(xué)院，江西 南昌 330108；3.紅塔遼寧煙草有限責(zé)任公司，遼寧 沈陽 110002

煙草是茄科煙屬的重要經(jīng)濟(jì)作物，煙葉是其主要收獲器官。自我國(guó)煙草行業(yè)大企業(yè)、大品牌、大市場(chǎng)發(fā)展戰(zhàn)略實(shí)施后，為提高優(yōu)質(zhì)煙葉供應(yīng)能力，國(guó)家煙草專賣局從2004年開始開展部分替代進(jìn)口煙葉生產(chǎn)示范工作，2009年6月30日，下發(fā)了《國(guó)家煙草專賣局關(guān)于啟動(dòng)特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)重大專項(xiàng)的通知》，標(biāo)志著涉及煙草工業(yè)、商業(yè)企業(yè)和相關(guān)研究機(jī)構(gòu)的特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)重大專項(xiàng)正式啟動(dòng)[1]。研究煙草特色優(yōu)質(zhì)性狀，如高香氣、高抗病性狀，定位及分析特殊性狀連鎖基因，培育優(yōu)質(zhì)煙葉品種，是開發(fā)特色優(yōu)質(zhì)煙葉，構(gòu)建中式卷煙優(yōu)質(zhì)特色煙葉原料保障體系的重要任務(wù)。

煙草性狀基因定位是指將性狀連鎖基因定位于某一特異的染色體上，測(cè)定基因在染色體上線性排列的順序和距離[2]。傳統(tǒng)的基因定位主要采用形態(tài)性狀的標(biāo)記及同工酶標(biāo)記，是對(duì)基因的間接反映。而分子標(biāo)記是DNA水平遺傳變異的直接反映。自1974年Grozdicker等[3]建立了第一個(gè)分子標(biāo)記以來，分子標(biāo)記在作物遺傳育種中得到廣泛應(yīng)用。煙草各種分子標(biāo)記遺傳連鎖圖的相繼建立[4-6]，為煙草性狀的基因定位及分子標(biāo)記輔助選擇奠定了良好基礎(chǔ)。我們簡(jiǎn)要綜述分子標(biāo)記在煙草化學(xué)、普通農(nóng)藝和抗病性等性狀連鎖基因定位中的應(yīng)用進(jìn)展，討論其存在的問題，展望其應(yīng)用前景，以期為分子標(biāo)記應(yīng)用于煙草性狀連鎖基因定位和特色優(yōu)質(zhì)煙葉育種分子標(biāo)記輔助選擇研究提供借鑒。

1 分子標(biāo)記技術(shù)

分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記[2]?，F(xiàn)已有幾十種分子標(biāo)記，按技術(shù)基礎(chǔ)可分為基于分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、限制性酶切結(jié)合PCR技術(shù)和DNA芯片技術(shù)等4類[7]。常用于煙草研究的分子標(biāo)記有擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)（inter-simple sequence repeat，ISSR）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA（ran?dom amplified polymorphic DNA，RAPD）、特異序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence specific amplification poly?morphism，SSAP）、特征序列擴(kuò)增區(qū)域（sequencecharacterized amplified regions，SCAR）等[8]。

2 煙草化學(xué)成分連鎖基因定位

特色優(yōu)質(zhì)煙葉具有化學(xué)成分、物理特性、內(nèi)在品質(zhì)和安全性等方面的特殊性，其中化學(xué)成分對(duì)物理特性、內(nèi)在品質(zhì)和安全性有重要影響?；瘜W(xué)成分一般屬于數(shù)量性狀，運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)建立遺傳連鎖圖做QTL分析，可更精確、有效地選擇最優(yōu)基因型[9]。

早在2006年，Julio等[10]對(duì)烤煙化學(xué)成分連鎖基因做了大量工作，通過AFLP、ISSR、SSAP、SCAR分子標(biāo)記對(duì)33個(gè)煙草化學(xué)指標(biāo)進(jìn)行定位，包括近紅外光譜檢測(cè)的煙堿、焦油、石油醚提取物、氯、氮、多酚類等18種成分，高效液相色譜檢測(cè)的總堿、煙堿、假木賊堿、去氫新煙堿、降煙堿和干物質(zhì)等6種成分，卷煙相關(guān)的CO、焦油、煙堿、總粒相物、苯并［α］芘等9個(gè)指標(biāo)。國(guó)內(nèi)肖炳光等[9]與李華麗等[11]利用ISSR、RAPD、SRAP分子標(biāo)記分析烤煙品種，分別發(fā)現(xiàn)了與總糖、煙堿、氧化鉀3種煙葉化學(xué)成分相關(guān)的7個(gè)加性效應(yīng)QTL、2個(gè)煙堿相關(guān)QTL、2個(gè)總氯相關(guān)QTL、1個(gè)總鉀相關(guān)QTL。

而針對(duì)具有特殊香氣的“大白筋599”，常愛霞[12]用RAPD引物Y466分析了“大白筋599”、一般香氣的“G28”及其Fl和F2的17個(gè)單株，結(jié)果表明擴(kuò)增出的多態(tài)性片段可能是與“大白筋599”的特殊香氣性狀連鎖的分子標(biāo)記。

白肋煙是中式混合型卷煙的重要原料，分子標(biāo)記也逐步用于白肋煙的研究。柴利廣[13]通過SRAP和AFLP分析，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)QTL位點(diǎn)與白肋煙煙堿合成連鎖，1個(gè)與總氮含量連鎖，并且3個(gè)位點(diǎn)在同一區(qū)間。蔡長(zhǎng)春等[14]也用上述2種分子標(biāo)記檢測(cè)到與煙堿（2個(gè)）、總氮（2個(gè)）和總糖（3個(gè)）相關(guān)的QTL，未檢測(cè)到與總鉀相關(guān)的QTL。

我國(guó)煙草界一直關(guān)注卷煙的“減害”，煙草化學(xué)成分是卷煙有害成分的來源或前體物。目前化學(xué)及物理手段的“減害”逐漸陷入瓶頸，通過基因工程控制煙草有害成分前景廣泛。利用分子標(biāo)記技術(shù)定位有害成分或前體物的控制基因，通過基因工程手段抑制其遺傳表達(dá)，可以從根本上降低煙草有害成分。

3 煙草普通農(nóng)藝性狀連鎖基因定位

煙草的農(nóng)藝、品質(zhì)等重要性狀多為數(shù)量性狀，易受環(huán)境影響，根據(jù)表型進(jìn)行育種選擇效率低。煙草普通農(nóng)藝性狀連鎖基因定位大多集中于影響煙葉產(chǎn)量的相關(guān)性狀研究。

2006年，Julio等[10]分析化學(xué)成分連鎖基因的同時(shí)，對(duì)煙葉采摘時(shí)間（5因素）、煙葉采后重量（5因素）、煙葉質(zhì)量（5因素）、煙葉生長(zhǎng)發(fā)育（5因素）、腋芽量、田間顏色、開花時(shí)間、形態(tài)類型、煙莖比重和地面總產(chǎn)量等26個(gè)煙草農(nóng)藝性狀指標(biāo)進(jìn)行了定位。

國(guó)內(nèi)煙草研究人員已利用SRAP、SSR、AFLP、ISSR對(duì)烤煙株高、莖圍、節(jié)距、葉片數(shù)、最大腰葉長(zhǎng)、最大腰葉寬[15]、中部葉長(zhǎng)[14]、莖葉夾角[11]、葉片數(shù)、腳葉長(zhǎng)、腳葉寬、腰葉長(zhǎng)[16]的相關(guān)QTL進(jìn)行定位。張吉順等指出，其研究中與株高、葉片數(shù)、腳葉寬和腰葉長(zhǎng)穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的SRAP標(biāo)記可應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇及候選基因研究。以上研究均未發(fā)現(xiàn)開花天數(shù)、成熟天數(shù)、頂葉長(zhǎng)、頂葉寬、主側(cè)脈角、總?cè)~數(shù)和中部葉寬相關(guān)的QTL。杜傳印[17]和譚效磊[18]采用雜交方法，分別通過AFLP和SSR分析，找到一個(gè)與控制白肋型葉色性狀基因相連鎖的AFLP標(biāo)記，檢測(cè)得到易烤性相關(guān)的4個(gè)QTL。

煙草普通農(nóng)藝性狀一直是煙農(nóng)關(guān)注的焦點(diǎn)，主要表現(xiàn)為烤煙的煙葉產(chǎn)量和易考性。將分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于提高產(chǎn)量與質(zhì)量矛盾下的煙葉產(chǎn)量，是一個(gè)重要的研究方向。

4 煙草抗病性連鎖基因定位

目前，分子標(biāo)記技術(shù)在煙草抗病性連鎖基因定位中應(yīng)用最多，抗病性也屬于農(nóng)藝性狀，由于研究報(bào)道較多，因此單獨(dú)列出論述。

4.1 煙草真菌病抗性基因定位

煙草常見的真菌病害有根黑腐病、赤星病、黑脛病、炭疽病、猝倒病和霜霉病等，其中煙草霜霉病在我國(guó)沒有發(fā)生病害。

據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，煙草研究人員利用分子標(biāo)記分析出了2個(gè)對(duì)抗煙草根黑腐病RAPD標(biāo)記[19]、1個(gè)抗白粉病相關(guān)QTL[11]、3個(gè)與抗赤星病相關(guān)QTL[20]、1個(gè)抗赤星病RAPD標(biāo)記[21]、1個(gè)抗赤星病SSR標(biāo)記[22]、2個(gè)抗黑脛病RAPD標(biāo)記[23-24]、7個(gè)黑脛病抗性相關(guān)QTL[25]和1個(gè)抗黑脛病SSR標(biāo)記[26]。以上分子標(biāo)記均可用于煙草育種中的分子標(biāo)記輔助選擇。

4.2 煙草細(xì)菌病抗性基因定位

煙草常見的細(xì)菌病害有青枯病、野火病、角斑病和細(xì)菌性黑莖病等，其中研究較多的是煙草青枯病。

Nishi等[27]利用AFLP標(biāo)記將對(duì)應(yīng)于青枯病抗性的一個(gè)QTL位點(diǎn)及與之相聯(lián)系的DNA標(biāo)記定位到一個(gè)32 cM長(zhǎng)、包含15個(gè)標(biāo)記的連鎖群中，另發(fā)現(xiàn)2個(gè)共顯性標(biāo)記M82和M84都與抗性基因連鎖。楊友才等[28]選用高感和高抗青枯病品種進(jìn)行RAPD分析，篩選出一個(gè)與抗青枯病基因連鎖的RAPD片段。

徐秀紅[29]從423個(gè)RAPD引物中篩選到與野火病抗性基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記S522000。Yi等[30]對(duì)1500個(gè)RAPD引物進(jìn)行篩選，鑒定了5個(gè)與煙草野火病抗性基因連鎖的RAPD標(biāo)記。Milla等[31]將篩選到的2個(gè)煙草霜霉病抗性基因的RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，并指出在大田、輔助標(biāo)記選擇中，這2個(gè)SCAR標(biāo)記可用于鑒定煙草是否有霜霉病抗性。

4.3 煙草病毒病抗性基因定位

煙草常見病毒病有煙草普通花葉病毒（TMV）病、黃瓜花葉病毒（CMV）病、蝕紋病毒病、馬鈴薯Y病毒（PVY）病和番茄斑萎病毒病等。

范靜苑等[32]用135對(duì)SSR引物進(jìn)行分子標(biāo)記分析，得到標(biāo)記SM1350與源于鐵把子的CMV抗性基因間的遺傳距離為8.64 cM，標(biāo)記SM2270與源于臺(tái)煙8號(hào)的CMV抗性基因間的遺傳距離為3.92 cM。

Noguchi等[33]用只在PVY抗性上有差異的煙草NIL進(jìn)行RAPD分析，找到10個(gè)標(biāo)記，這些標(biāo)記只在感病品種中存在，并經(jīng)過Southern雜交證實(shí)。王貴等[34]從多條RAPD引物和一對(duì)SCAR引物中，篩選出2個(gè)與PVY抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，并指出二者可用于抗PVY抗性育種。

高玉龍等[35]通過分子標(biāo)記分析結(jié)合田間TMV抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)TMV抗性基因位于標(biāo)記N2和XS?RP1x26之間，標(biāo)記與品種（系）的TMV抗性吻合率達(dá)97.62%。許石劍[36]分析了Ti245抗TMV的遺傳規(guī)律，并對(duì)抗性基因進(jìn)行SSR標(biāo)記定位，發(fā)現(xiàn)Ti245抗TMV的位點(diǎn)位于LG9連鎖群，標(biāo)記*Tp217200距目的基因最近，遺傳距離為3.3 cM。

Moon和Nicholson[37]利用AFLP建立了3個(gè)與煙草番茄斑萎病毒抗性基因緊密連鎖的標(biāo)記，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。

4.4 煙草蟲害抗性基因定位

已發(fā)現(xiàn)6種煙草線蟲病害，分別是煙草南方根結(jié)線蟲病、北方根結(jié)線蟲病、爪哇根結(jié)線蟲病、花生根結(jié)線蟲病、煙草孢囊線蟲病和草原線蟲根褐腐病。

Yi等[38]利用RAPD標(biāo)記分析根結(jié)線蟲抗性基因，將16個(gè)RAPD標(biāo)記定位在24.1 cM距離內(nèi)的6個(gè)位點(diǎn)上，其中6個(gè)RAPD標(biāo)記定位在Rk位點(diǎn)。王揚(yáng)等[39]發(fā)現(xiàn)RAPD引物OPJ13能在所有感根結(jié)線蟲病品種中擴(kuò)增出一條780 bp的片段，而該片段在所有抗病品種的擴(kuò)增產(chǎn)物中均未發(fā)現(xiàn)，因此此標(biāo)記極有可能是與煙草感病基因相連鎖的分子標(biāo)記。

煙草病害多達(dá)116種以上，僅我國(guó)煙草上侵染性病害已達(dá)68種以上，且新的病害在不斷增加。煙草病害是影響煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素。加強(qiáng)分子標(biāo)記定位煙草抗性基因，進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)培育煙草抗病品種，具有廣闊的發(fā)展前景。

5 討論與展望

5.1 加強(qiáng)新型分子標(biāo)記技術(shù)在煙草中的應(yīng)用

分子標(biāo)記技術(shù)可以運(yùn)用于煙草品種鑒定、種質(zhì)資源分析、遺傳分析、基因定位、輔助選擇、病蟲害分析等多方面的研究。從總體上看，分子標(biāo)記在煙草上的運(yùn)用，目前取得的進(jìn)展也還相對(duì)落后與其他作物如水稻、小麥等。如穩(wěn)定性更高的SCAR標(biāo)記，僅應(yīng)用于煙草品種鑒定和基因定位等方面[40-41]；多態(tài)性豐富的、能反應(yīng)單核苷酸變異的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）標(biāo)記，在煙草中的應(yīng)用尚屬空白[42]。因此，配置相關(guān)設(shè)備和軟件，加強(qiáng)新型分子標(biāo)記技術(shù)在煙草中的應(yīng)用，是煙草研究人員的重要任務(wù)。

5.2 加強(qiáng)煙草特殊性狀的基因定位與分析

近年來，由于安全性和重金屬等問題，煙草處于輿論漩渦中心。運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)加強(qiáng)煙草有害化學(xué)成分的連鎖基因研究，開發(fā)特色優(yōu)質(zhì)、安全性高的煙葉品種，從品種開始“減害降焦”，是煙草農(nóng)業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)。加強(qiáng)煙草高香氣性狀連鎖基因的研究，培育特色香氣煙草品種，對(duì)建立特色風(fēng)格、特色香氣的“中式卷煙”原料基礎(chǔ)具有重要意義。

5.3 加強(qiáng)分子標(biāo)記在野生煙草性狀中的研究

目前已發(fā)現(xiàn)的煙屬作物有66種，其中多數(shù)是野生種，被煙草行業(yè)栽培利用的只有紅花煙草（Nicoti?ana tabacum L）和黃花煙草（N.rustica L）[43]。雖然野生煙草沒有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但其獨(dú)有的某些抗病性、香氣成分等性狀是普通煙草所欠缺的?？疾煲吧鸁煵萏厥庑誀畹膬?yōu)良性，利用分子標(biāo)記定位其連鎖基因，將其引入普通煙草育種，可為解決我國(guó)在煙草育種上面臨的過度依賴主體親本、育成品種遺傳基礎(chǔ)狹窄、主要性狀趨同等問題開辟新途徑。

5.4 加強(qiáng)特殊性狀連鎖基因定位的后續(xù)研究

大多數(shù)研究集中于定位煙草特殊形狀連鎖基因，對(duì)連鎖基因的序列分析、表達(dá)形式及作用機(jī)理等的研究較少。因此，要進(jìn)一步加強(qiáng)特殊性狀控制基因定位的后續(xù)研究，掌握連鎖基因的作用機(jī)理，將其運(yùn)用到煙草基因工程育種中，為培育高抗性、適合工業(yè)需求的新品種提供新途徑。

5.5 加強(qiáng)研究資源的合理配置

目前，國(guó)內(nèi)研究煙草分子標(biāo)記、基因工程育種的人員較多，高校、研究所、工業(yè)及商業(yè)企業(yè)都有相關(guān)研究人員。應(yīng)合理分配研究資源，避免同類研究，對(duì)減少資源浪費(fèi)，加快研究進(jìn)度都有重要意義。地方研究人員應(yīng)注重當(dāng)?shù)責(zé)煵萘餍胁『Φ难芯俊?/p>

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