芽孢桿菌對腸道菌群結(jié)構(gòu)影響的研究進(jìn)展

吳高峰，黃占旺

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室，江西 南昌 330045)

益生菌(probiotics)是指對人和動植物有益的菌，應(yīng)用于人體的益生菌有雙歧桿菌、乳桿菌、枯草芽孢桿菌(含納豆芽孢桿菌)、蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、丁酸梭菌和酵母菌等[1]，可見芽孢桿菌在益生菌中占有很大的比重。芽孢桿菌(Bacillus)是指能形成芽孢的桿菌或球菌，對外界有害因子抵抗力強、繁殖速度快，生存能力強，廣泛存在于動物腸道中。

1 芽孢桿菌對腸道菌群的調(diào)節(jié)

人和動物的胃腸道棲息的細(xì)菌大約有30個屬500多種，主要由厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌組成，其中專性厭氧菌占99%以上。腸道中的細(xì)菌根據(jù)它們的功能可分為三個部分：生理性細(xì)菌、條件致病菌和病原菌。生理性細(xì)菌為專性厭氧菌，是腸道的優(yōu)勢菌群，如雙歧桿菌等，芽孢桿菌屬于此類。下面介紹幾種芽孢桿菌對腸道菌群的調(diào)節(jié)。

1.1 納豆芽孢桿菌對腸道菌群的調(diào)節(jié)

納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)是具有耐酸、耐熱特性的有益菌，在胃酸下4h存活率為100%，是各種有益菌當(dāng)中對環(huán)境耐受力最好并且可以直達(dá)小腸的菌種之一。它能改變?nèi)梭w腸道細(xì)菌叢生態(tài)，具有強力的病原菌抑制能力，可以產(chǎn)酸，調(diào)節(jié)腸道菌群。陳兵等[2]發(fā)現(xiàn)納豆芽孢桿菌增加了腸道厭氧菌群中的雙歧桿菌、乳酸桿菌、梭菌和擬合桿菌數(shù)量，而減少了腸桿菌、腸球菌等需氧菌群數(shù)量。黃俊才等[3]發(fā)現(xiàn)納豆芽孢桿菌顯著提高了仔豬結(jié)腸內(nèi)容物中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量，與甘露聚糖(MOS)聯(lián)用時大腸桿菌數(shù)量顯著下降且粘膜上乳酸桿菌數(shù)量上升。吳德華等[4]研究發(fā)現(xiàn)，添加不同濃度的納豆芽孢桿菌顯著增加了乳酸桿菌數(shù)量而極顯著降低大腸桿菌數(shù)量，而未添加納豆芽孢桿菌大腸桿菌數(shù)量卻極顯著上升。試驗證明，添加納豆芽孢桿菌有助于增加胃腸道的益生菌生長，而對需氧菌或腸桿菌腸球菌等產(chǎn)生拮抗作用，減少致病菌的定植。

1.2 地衣芽孢桿菌對腸道菌群的調(diào)節(jié)

地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)是芽孢桿菌中具有較大潛力的菌種之一，它能夠通過以菌治菌、生物奪氧的方法抑制致病菌的生長。郭貴海等[5]發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌口服后以活菌方式進(jìn)入腸道并產(chǎn)生短桿菌肽、枯草桿菌肽、制霉菌素和頭孢菌素C等抗菌活性物質(zhì)，抑制腸道中的致病菌。劉波等[6]研究發(fā)現(xiàn)，投喂地衣芽孢桿菌，異育銀鯽食糜中芽孢桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量顯著增加，而大腸桿菌的數(shù)量顯著降低。全艷玲等[7]運用菌菌混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌對病原微生物具有抑制作用，而對雙歧桿菌、乳酸菌有促進(jìn)或共生作用。景翠等[8]發(fā)現(xiàn)日糧中添加地衣芽孢桿菌對平衡腸道菌群、改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)效果明顯。

1.3 枯草芽孢桿菌對腸道菌群的調(diào)節(jié)

枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性需氧菌，對大腸桿菌等有害微生物有很強的抑制作用。李衛(wèi)芬等[9]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂基礎(chǔ)日糧加枯草芽胞桿菌制劑組肉雞空腸和盲腸內(nèi)容物中乳酸菌、芽孢桿菌數(shù)量顯著增加，而大腸桿菌數(shù)量顯著降低。說明枯草芽孢桿菌也能促進(jìn)厭氧菌而抑制需氧菌的生長，從而調(diào)節(jié)腸道菌群?？莶菅挎邨U菌能夠很好地調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)系統(tǒng)，是因為迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造成腸道低氧，促進(jìn)有益厭氧菌生長，并產(chǎn)生乳酸等有機酸類，降低腸道pH值，間接抑制致病菌生長。

2 芽孢桿菌調(diào)節(jié)腸道菌群的研究方法

2.1 取 樣

研究腸道菌群，首先進(jìn)行的就是取樣，常用方法是糞便取樣和腸道內(nèi)容物取樣。糞便取樣常采用逼迫法，即在無菌環(huán)境下取小鼠糞便幾顆，置于滅菌后的離心管中，加入幾粒小的鋼珠，進(jìn)行離心，即為所需樣品。腸道內(nèi)容物取樣一般在無菌條件下從結(jié)腸(腸襻中部)中取內(nèi)容物，洗去食糜，于滅菌離心管中離心得到樣品[10]；另外用滅菌載玻片刮取腸壁粘膜，并測量其腸內(nèi)壁面積，計數(shù)后計算每平方厘米的粘膜中各種菌的數(shù)量[3]。

2.2 檢 測

人體內(nèi)的微生物以細(xì)菌為主，重量約為1.5~2kg，其中腸道中約有1kg以上，每克腸道內(nèi)容物中棲居約1012個細(xì)菌，含有至少500個種，其中厭氧菌占優(yōu)勢。研究腸道菌群，過去通常采用分離純化后鑒定，隨著檢測技術(shù)水平的提高，檢測腸道菌群的方法也越來越先進(jìn)。筆者將其分為兩類進(jìn)行介紹：傳統(tǒng)檢測方法和現(xiàn)代檢測方法。

(1)傳統(tǒng)檢測方法。傳統(tǒng)的檢測方法主要是利用細(xì)胞培養(yǎng)法。采用平板涂布法分離純化，再用特殊培養(yǎng)基BS(厭氧菌)和EC(需氧菌)，然后在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，挑取各典型菌落，通過劃線法再培養(yǎng)，獲得的菌株根據(jù)其形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀和生化反應(yīng)特性進(jìn)行分析鑒定。針對厭氧菌和需氧菌的鑒定，筆者從革蘭氏染色的結(jié)果、形態(tài)及排列、有無莢膜及芽孢、有無鞭毛以及在特殊培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征，確定腸道菌群中細(xì)菌類型[2,7]。細(xì)胞培養(yǎng)法雖然在檢測菌群具有典型性、高靈敏性、特異性，但因為過程的復(fù)雜性和效率低，通常需要花費48h甚至更長時間[11]?？膳囵B(yǎng)的微生物僅占微生物總數(shù)的0.1%~10%[12]，因此忽略了大量的不可培養(yǎng)的微生物，分析時往往低估腸道菌群的多樣性，很難全面的反映腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征。培養(yǎng)基的差異以及培養(yǎng)方法的敏感性也會使得試驗結(jié)果不同，導(dǎo)致分度低的細(xì)菌漏檢和過低估計[13]。

(2)現(xiàn)代檢測方法。隨著現(xiàn)代微生物學(xué)和分子生物學(xué)的快速發(fā)展，腸道菌群檢測方法也更加全面、準(zhǔn)確?，F(xiàn)代檢測技術(shù)能夠更有效的分析生物多樣性，而且可以推測到菌株間的親緣關(guān)系，對深入了解益生菌及其在腸道中的功能將有重大幫助。研究腸道菌群的現(xiàn)代檢測技術(shù)方法種類繁多，下面介紹幾種典型的技術(shù)。

① 質(zhì)譜分析(MS)。近年來質(zhì)譜分析有了顯著的發(fā)展，尤其是MALDI-TOF-MS(基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜)的應(yīng)用，可以解決細(xì)菌的全菌分析。該技術(shù)直接在樣品板上涂樣品，點加基質(zhì)后進(jìn)行分析，通過數(shù)據(jù)庫檢索配對或者與已知的細(xì)菌進(jìn)行比較，實現(xiàn)細(xì)菌的鑒定。在對MALDI-TOF-MS技術(shù)作進(jìn)一步可行性評估發(fā)現(xiàn)，它可用于快速準(zhǔn)確的微生物分析，可以在最小的細(xì)胞數(shù)量和混合菌群中識別細(xì)菌，能對大量的目標(biāo)進(jìn)行分析，不需要事先選擇特定的抗體或者底物識別[14]。有文獻(xiàn)研究表明，運用PCR與MALDI-TOF-MS結(jié)合，可實現(xiàn)快速鑒定細(xì)菌[15]。雖然該技術(shù)操作簡單，但因為已有的圖譜很少，所以只能鑒定部分的菌株[16]。

② 高效液相色譜法（HPLC）。高效液相色譜法是將樣品稀釋離心，通過弱陰離子交換色譜進(jìn)一步除雜，再將細(xì)菌樣品置于高效液相陰離子交換色譜分離，分離完成后用洗脫液洗出細(xì)菌完整細(xì)胞，最后將洗出液進(jìn)行紫外吸收和光散射檢測器檢測。高效液相色譜法經(jīng)過顯微鏡檢查，平板培養(yǎng)，色譜分析，軟件計算出脫峰面積，通過與菌落計數(shù)結(jié)果比較其相關(guān)性。這一方法的最大特點之一是樣品的非破壞性，有可能真實地反映所研究體系中微生物的組成和生存狀態(tài)。雖然它可以可靠的應(yīng)用于同一個體在不同生理條件下對腸道菌群研究或不同個體之間的研究，但是對細(xì)菌種群的確定需進(jìn)一步研究[17]。

③ 16S rRNA/16S rDNA。16S rRNA實時熒光定量PCR檢測方法的建立，為正確定量檢測腸道中的細(xì)菌菌群數(shù)量提供一種特異性高、靈敏性強的試驗方法。16S rRNA主要包括三個步驟：基因組DNA獲得，16S rRNA基因片段獲得，16S rRNA基因序列分析[18]。RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)是典型的一種運用16S rDNA方法來分析腸道微生物的現(xiàn)代檢測方法，它包括細(xì)菌總DNA的提取、細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴增與純化、16S rDNA克隆文庫的構(gòu)建、文庫的統(tǒng)計分析和測序與序列分析。RFLP雖然可以直接定量分析，但是很多條帶與群落成員無關(guān)。TRFLP(終端限制性片段長度多態(tài)性)可以用于分析個體間腸道微生物的快速篩選，TRFLP具有高分辨率、可以在泳道內(nèi)標(biāo)記、直接定量分析片段，但無法獲得種系發(fā)生信息，而且設(shè)備昂貴，雖可估計系統(tǒng)發(fā)育多樣性和在各種環(huán)境樣品中的微生物組成，不能用于一個特定大量細(xì)菌的定量[19]。16S rDNA具有高度保守性和種屬差異性、普遍性和準(zhǔn)確性，但存在相當(dāng)耗時、費力、昂貴等缺點[20]。

④ 熒光原位雜交技術(shù)(FISH)。熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization），簡稱FISH。1988年，Giovannoni等[21]首次將ISH（原位雜交技術(shù)）引入細(xì)菌學(xué)研究，使用放射性標(biāo)記rRNA寡聚核苷酸探針檢測微生物。FISH最常用的靶序列是16S rRNA，根據(jù)rRNA目標(biāo)區(qū)域可設(shè)計寡聚核苷酸探針，進(jìn)行種屬特異性分析。Schulz等[22]利用FISH技術(shù)檢測到了巨大的納米比亞硫酸鹽細(xì)菌，直徑0.5mm。FISH技術(shù)也可以與其它儀器或技術(shù)聯(lián)用從而快速方便獲得試驗結(jié)果，如結(jié)合流式細(xì)胞儀可以檢測分析小鼠腸道中微生物的類別和數(shù)量，此方法適用于對有關(guān)微生物群落進(jìn)行快速和頻繁檢測，而且自動化操作水平高。王瑾等[23]運用此方法發(fā)現(xiàn)小鼠糞便中厭氧菌、球形梭菌屬、腸桿菌、擬桿菌屬的數(shù)量變化效果明顯。

⑤ PCR技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)由Mullis等首創(chuàng)于1985年，它的出現(xiàn)被譽為分子生物學(xué)發(fā)展史上的里程碑。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)通常與變性梯度凝膠電泳(DGGE)、腸道細(xì)菌基因間重復(fù)序列(ERIC)等技術(shù)聯(lián)用，并且取得了很好的效果。ERIC-PCR，是利用ERIC序列在不同細(xì)菌間的分布和拷貝數(shù)不同，通過擴增細(xì)菌ERIC相關(guān)序列的擴增產(chǎn)物在電泳圖譜上呈現(xiàn)獨特的位置和其序列分析，達(dá)到鑒別細(xì)菌屬種株的目的。1999年，Giovanni等將ERIC-PCR方法應(yīng)用于混合菌群的研究，并逐步用于微生物群落的分析[24]。ERIC-PCR能從群落整體或是從功能狀態(tài)角度反映群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化和變化趨勢，并且擴增的條帶清晰，數(shù)量適中，同一組受試者中高速穩(wěn)定，對腸道微生態(tài)的研究提供了一種可靠的方法。變性梯度凝膠電泳通過凝膠顯示DNA片段遷移，已成為一種常用的16S rRNA指紋圖譜，其樣品可直接進(jìn)行多樣性分析而不需要微生物培養(yǎng)，能檢測到體外培養(yǎng)困難甚至不能培養(yǎng)的細(xì)菌，1%左右[25]的細(xì)菌種群即可通過PCR-DGGE檢測到。PCR-DGGE技術(shù)研究重組人溶菌酶對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響中發(fā)現(xiàn)一種不可培養(yǎng)的未知菌厚壁菌門細(xì)菌[26]。盡管PCR-DGGE技術(shù)是研究菌群多樣性和結(jié)構(gòu)特征的常規(guī)技術(shù)，但它需要特殊的儀器設(shè)備且操作嚴(yán)格，只能鑒定群落成員和短片段分析，有時會形成雙鏈或異源分子且電泳影響因素多，影響結(jié)果。實時PCR擁有高分辨率，但是很少用于復(fù)合菌群量化[27]，而rep-PCR具有快速靈敏可重復(fù)和可靠性，在分子微生態(tài)學(xué)研究中有廣闊的應(yīng)用前景[28]。

⑥ 宏基因組技術(shù)應(yīng)用。近年來基因組學(xué)技術(shù)日臻成熟為微生物學(xué)研究提供了新的研究方法和機遇。宏基因組(Metagenome)這一術(shù)語由Handelsman等1998年提出的[29]，其定義為環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和。宏基因組學(xué)（Metagenomics）是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法[30]。以前要想對腸道微生物進(jìn)行分析，就必須侵入到動物腸道收集微生物樣本，這種方法難度高且成本大；隨著技術(shù)發(fā)展，現(xiàn)在只要通過采集動物的糞便或腸道內(nèi)容物，就可進(jìn)行腸道菌群基因組的研究。它避免了傳統(tǒng)微生物學(xué)基于純培養(yǎng)研究的限制，為充分認(rèn)識和開發(fā)利用未培養(yǎng)微生物，并從群落水平上完整地認(rèn)識微生物提供了可能。第一個全基因組測序的乙型流感為細(xì)菌基因組測序開了一扇窗，現(xiàn)在有超過700個細(xì)菌基因組測序已經(jīng)完成或者正在測序[31]。基因組學(xué)時代的到來，使得整個基因組測序越過生物學(xué)的技術(shù)壁壘，實現(xiàn)在基因組轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)化水平定量生物分析[32]。

宏基因組學(xué)技術(shù)一般包括樣品總DNA的提取、與載體連接和克隆到宿主中，最后進(jìn)行文庫分析與篩選。目前獲得腸道菌群總DNA主要有酚/氯仿抽提法、Chelex-100煮沸法、GuSCN/silica法以及商業(yè)試劑盒等。郭海勇等研究了三種DNA方法，確定CTAB-SDS 法效果最好，提取的基因組 DNA 可用于后續(xù)實驗PCR擴增的模板，能保證研究結(jié)果的可靠性，且該方法不需要特殊的儀器設(shè)備，成本低廉，操作簡便[33]。尋找和開發(fā)更適合表達(dá)載體以及如何高效、高靈敏度地篩選活性克隆子是應(yīng)用該技術(shù)的關(guān)鍵問題。載體一般分為克隆載體、表達(dá)載體和穿梭載體，一般選擇克隆載體，其中質(zhì)粒是最常用的載體。轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)化效率、宏基因的表達(dá)量、目標(biāo)性狀等是選擇宿主需要考慮的因素，大腸桿菌是最常用的宿主。宏基因組文庫既包含可培養(yǎng)的又包含未能培養(yǎng)的微生物基因，避開了微生物分離培養(yǎng)的問題，極大地擴展了微生物資源的利用空間[34]?；蚪M文庫篩選主要有四種方法：功能篩選、序列篩選、底物誘導(dǎo)基因表達(dá)篩選和化合物結(jié)構(gòu)水平篩選。經(jīng)過篩選，使得新基因活性產(chǎn)物表達(dá)。

近年來，依靠宏基因組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一些傳統(tǒng)培養(yǎng)法研究未發(fā)現(xiàn)的新種類，促進(jìn)了對復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)的認(rèn)識。Walter等[35]對小鼠大腸微生物群構(gòu)建了宏基因組文庫，并對表達(dá)β-葡聚糖酶活性的克隆進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)2個克隆是來自不可培養(yǎng)的微生物。Ley等[36-37]對小鼠腸道中5 088個rRNA序列分析發(fā)現(xiàn)，有64%的序列是未知的屬，只有7%是已知可培養(yǎng)的，再對11 831個健康成年人結(jié)腸粘膜和糞便里分離的細(xì)菌16S rRNA，發(fā)現(xiàn)九個分枝，60%~80%的序列是厚壁菌門，20%~40%是擬桿菌門。Manichanh等[38]利用宏基因組方法研究發(fā)現(xiàn)階段性回腸炎患者腸道微生物多樣性大大降低，尤其是硬壁菌門的細(xì)菌種類大大減少。Shedova等[39]在人體腸道中發(fā)現(xiàn)了一種叫做多形擬桿菌新種5482(Bacteriodes thetaiotaomicronVPI-5482)，它是革蘭氏陰性菌厭氧細(xì)菌，有凈化腸道的功能。聶志強等[40]采用宏基因組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)醋酸發(fā)酵過程中乳酸菌和醋酸菌是優(yōu)勢菌群。

采用宏基因組技術(shù)，可直接研究微生物群體中某特定微生物基因組的結(jié)構(gòu)與功能，擺脫了傳統(tǒng)微生物學(xué)研究對純培養(yǎng)的依賴，使未培養(yǎng)微生物的認(rèn)識和開發(fā)成為可能[41]。它提供了一種探知微生物多樣性結(jié)構(gòu)和功能基因組的方法，是一條尋找新基因產(chǎn)物的新途徑。

3 展 望

在過去20余年間，由于克服了傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)的限制，一些不依賴傳統(tǒng)培養(yǎng)的研究技術(shù)發(fā)展改變了人們對自然界微生物多樣性的認(rèn)識。自然界有超過99%的微生物目前無法在實驗室中進(jìn)行培養(yǎng)，所以找到一種方法來描述、接近和利用這些未培養(yǎng)的微生物是微生物研究的方向。在抗生素污染問題越來越嚴(yán)重的今天，過多藥物的應(yīng)用造成腸道菌群平衡紊亂，使一些非致病菌死亡，腸道菌群平衡失調(diào)，從而引起長期腹瀉或者缺乏維生素等反應(yīng)，造成人體傷害，有益的芽孢桿菌的應(yīng)用，是解決抗生素問題的一個有效方案。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，益生菌將會開發(fā)成為一種理想的腸道菌群調(diào)節(jié)劑，以促進(jìn)食品工業(yè)的發(fā)展和人民群眾的健康。腸道菌群研究方法的進(jìn)步，尤其是宏基因組的應(yīng)用，大大的避開了微生物分離培養(yǎng)的問題，極大擴展了微生物的資源利用空間，增加了獲得新生物活性物質(zhì)的機會，因此宏基因組學(xué)的應(yīng)用將是未來科學(xué)研究的趨勢。腸道菌群的研究對于弄清益生菌影響腸道功能的作用方式、作用機理是非常有用的，相信隨著技術(shù)水平的進(jìn)一步提升，將會更趨向高速化、精確化、靈敏化。

[1]蔡凱凱,黃占旺,葉德文,等.益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群及免疫調(diào)節(jié)作用機理[J].中國飼料,2011(18):34-37.

[2]陳兵,朱鳳香,陳巧云,等.納豆芽孢桿菌分離純化及對大白鼠腸道微生態(tài)系統(tǒng)的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2003,15(4):223-227.

[3]黃俊才,林映才,馮定遠(yuǎn),等.納豆菌、甘露寡糖對仔豬腸道pH、微生物區(qū)系及腸黏膜形態(tài)的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2005,36(10):1021-1027.

[4]吳德華,杜莉,徐漢坤,等.納豆芽孢桿菌對仔犬日增重和腸道菌群的影響[J].家畜生態(tài)學(xué)報,2009,30(3):64-67.

[5]郭貴海,王崇文.腸道菌群調(diào)節(jié)劑的研究進(jìn)展[J].臨床內(nèi)科雜志,2002,19(2):88-90.

[6]劉波,謝駿,劉文斌,等.地衣芽孢桿菌與低聚木糖對異育銀鯽消化酶活性、腸道菌群及生長的影響[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報,2006,21(4):336-340.

[7]全艷玲.地衣芽孢桿菌對有害微生物的拮抗作用[J].食品科學(xué),2012,23(8):67-69.

[8]景翠,李福彬,趙駐軍,等.日糧添加地衣芽孢桿菌對蛋雞腸道菌群與形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響[J].中國家禽,2012,34(4):18-20.

[9]李衛(wèi)芬,李雅麗,秦艷,等.枯草芽孢桿菌對肉雞腸道消化酶活性、黏膜結(jié)構(gòu)及腸道菌群組成的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2012,32(5):666-669.

[10]高巍,孟慶翔.生長育肥豬胃腸道正常厭氧菌群的數(shù)量和分區(qū)[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2000,5(5):88-93.

[11]Hsieh S Y,Tseng C L,Lee Y S,et al.Highly efficient classification and identification of human pathogenic bacteria by MALDI-TOF MS[J].Molecular and Cellular Proteomics,2008,7(2):448-456.

[12]Amann R I,Ludwig W,Schleifer K H.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J].Microbiological Reviews,1995,59(1):143-169.

[13]朱義芳,趙聰,孫曉濱,等.腸道菌群檢測方法學(xué)評價及其在腸易激綜合征中的應(yīng)用[J].國際消化病雜志,2011,31(2):78-82.

[14]Wang Z P,Russon L,Li L,et al.Investigation of spectral reproducibility in direct analysis of bacteria proteins by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,1998,12(8):456-464.

[15]Von Wintzingerode F,Bocker S,Schlotelburg C,et al.Base-specific fragmentation of amplified 16S rRNA genes analyzed by mass spectrometry:A tool for rapid bacterial identification[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(10):7039-7044.

[16]劉海洪,杜宗敏,楊瑞馥.MALDI TOF MS在細(xì)菌檢測和鑒定中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2003,31(2):47-53.

[17]陳章捷,時祥柱,林娟,等.采用高效離子交換色譜分離分析動物腸道菌群方法初探[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2006,12(2):278-282.

[18]Lyra A,Rinttil T,Nikkil J,et al.Diarrhoea–predominant irritable bowel syndrome distinguishable by 16S rRNA gene phylotype quantification[J].World Journal of Gastroenterology,2009,15(47):5936-5945.

[19]Liu W T,Marsh T L,Cheng H,et al.Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA[J].Applied and Environmental Microbiology,1997,11(63):4516-4522.

[20]Kocherginskaya S A,Aminov R I,White B A.Analysis of the rumen bacterial diversity under two different diet conditions using denaturing gradient gel electrophoresis,random sequencing,and statistical ecology approaches[J].Environmental Microbiology,2001,7(3):119-134.

[21]Giovannoni S J,Delong E F,Olsen G J,et al.Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide probes for identification of single microbial cells[J].Journal of Bacteriology,1988,170(2):720-726.

[22]Schulz H N,Brinkhoff T,Ferdelman T G,et al.Dense populations of a giant sulfur bacterium in Namibian Shelf sediments[J].Science,1999,284(5413):493-495.

[23]王瑾,楊麗杰.使用FISH-FC測定益生菌對小鼠腸道菌群失衡的調(diào)節(jié)作用[J].食品科學(xué),2011,32(15):214-219.

[24]Di Giovanni G D,Watrud L S,Seidler R J,et al.Fingerprinting of mixed bacterial strains and biolog gram-negative(GN)substrate communities by enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-PCR(ERIC-PCR)[J].Current Microbiology,1999,38(4):217-223.

[25]Varga A,James D.Detection and differentiation of Plum pox virus using real-time multiplex PCR with SYBR Green and melting curve analysis:A rapid method for strain typing[J].Journal of Virological Methods,2005,123(2):213-220.

[26]李義,蘇運芳,齊雪峰,等.PCR-DGGE技術(shù)研究重組人溶菌酶對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2013,33(9):1345-1351.

[27]Wu J H,Liu W T.Quantitative multiplexing analysis of PCR-amplified ribosomal RNA genes by hierarchical oligonucleotide primer extension reaction[J].Nucleic Acids Research,2007,35(11):82.

[28]劉霞,劉杜蘭,解奕瑞,等.基于16S rRNA基因和細(xì)菌基因組間重復(fù)序列的DNA指紋圖譜技術(shù)對肝硬化大鼠肝移植后腸道菌群多樣性的研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2010,22(3):193-198.

[29]Handelsman J,Rondon M R,Brady S F,et al.Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes:A new frontier for natural products[J].Chemistry and Biology,1998,5(10):245-249.

[30]Qin J,Li R,Raes J,et al.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing [J].Nature,2010,464(7285):59-65.

[31]Fleischmann R D,Adams M D,White O,et al.Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd[J].Science,1995,269(5223):496-512.

[32]Yang R F,Guo X K,Yang J,et al.Genomic research for important pathogenic bacteria in China[J].Science in China Series C:Life Sciences,2009,52(1):50-63.

[33]郭海勇,于超,郭偉生,等.小鼠胚胎胃腸道細(xì)菌基因組 DNA 提取方法比較[J].技術(shù)與方法,2011,21(4):37-40.

[34]李麗娟,張殿昌,龔世園.宏基因組技術(shù)在開發(fā)未培養(yǎng)環(huán)境微生物基因資源中的應(yīng)用[J].水利漁業(yè),2007,27(3):7-10.

[35]Walter J,Mangold M,Tannock G W.Construction,analysis,and beta-glucanase screening of a bacterial artificial chromosome library from the large-bowel microbiota of mice[J].Applied Environmental Microbiology,2005,71(5):2347-2354.

[36]Ley R E,Backhed F,Turnbaugh P,et al.Obesity alters gut microbial ecology[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005,102(31):11070-11075.

[37]Ley R E,Peterson D A,Gordon J I.Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine[J].Cell,2006,124(4):837-848.

[38]Manichanh C,Rigottier-Gois L,Bonnaud E,et al.Reduced diversity of faecal microbiota in Crohn’s disease revealed by a metagenomic approach[J].Gut,2006,55(2):205-211.

[39]Shedova E N,Berezina N A,Lunina N A,et al.Cloning and characterisation of a large metagenomic DNA fragment containing Glycosyl-Hydrolase Genes[J].Molecular Genetics,Microbiology and Virology,2009,24(1):12-16.

[40]聶志強,韓玥,鄭宇,等.宏基因組學(xué)技術(shù)分析傳統(tǒng)食醋發(fā)酵過程微生物多樣性[J].食品科學(xué),2013,34(15):198-202.

[41]Wexler M,Bond P L,Richardson D J,et al.A wide host-range metagenomic library from a waste water treatment plant yields a novel alcohol/ aldehyde dehydrogenase[J].Environmental Microbiology,2005,7(12):1917-1926.