基孔肯雅病毒檢測方法及進(jìn)展

吳忠華，秦秀英，羅鵬

浙江國際旅行衛(wèi)生保健中心，浙江 杭州 310003

基孔肯雅熱（Chikungunya fever，CHIK）是由基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）引起，以伊蚊等為主要傳播媒介，以發(fā)熱、皮疹及關(guān)節(jié)疼痛為主要臨床特征的急性傳染病[1]。

CHIKV 屬披膜病毒科甲病毒屬，1997 年被正式命名，為單股正鏈RNA 病毒，其基因組RNA 總長11 805 個核苷酸。該病毒呈嗜熱性，在溫帶地區(qū)不宜生存，且具有3～4 年的間歇性流行特點，大多是在雨季過后開始暴發(fā)流行。1952年，CHIK首次在坦桑尼亞南部尼瓦拉州流行；20 世紀(jì)60 年代以后，CHIK流行區(qū)域不斷擴(kuò)大，向東推移至東南亞地區(qū)，并一步步逼近我國南方[2-3]。2008 年3 月，廣東檢驗檢疫局衛(wèi)生檢疫實驗室從赴斯里蘭卡務(wù)工回國的勞務(wù)人員血清樣本中檢測出CHIKV，是我國首例CHIK 輸入性病例。CHIK 臨床表現(xiàn)和登革熱等極其相似，容易造成誤診。目前CHIK 主要的檢測技術(shù)有病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測等。我們對CHIKV的實驗室檢測方法及研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 病毒的分離培養(yǎng)

CHIKV 可在C6/36、BHK-21、Vero、HeLa 及原代地鼠腎細(xì)胞和非洲綠猴腎Vero76 細(xì)胞中增殖，也可用乳鼠、蚊蟲等進(jìn)行增殖[4-5]。Lakshmi 等將32例經(jīng)RT-PCR 檢測為CHIKV 陽性的患者血清用C6/36 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，20例培養(yǎng)陽性[6]。Dash 等[7]對22例CHIKV 確診病 例血清進(jìn)行培養(yǎng)，20例陽性；45例CHIKV 陽性血清用BHK-21 細(xì)胞培養(yǎng)，陽性15例，同時用RT-LAMP 法檢測，陽性38例。病毒分離方法包括乳鼠腦內(nèi)接種、脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)、蚊蟲細(xì)胞培養(yǎng)等，最常用的分離方法是細(xì)胞培養(yǎng)法。病毒分離培養(yǎng)是CHIKV 實驗室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，特異性高，不僅可用于疾病的診斷，同時還可對所分離毒株進(jìn)行來源、特征等方面的鑒定。但該方法對實驗技術(shù)、條件等要求高，所需時間長，靈敏度相對較低，限制了其臨床應(yīng)用推廣。

2 血清學(xué)檢測

2.1 間接免疫熒光法

間接免疫熒光法是將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)的抗原反應(yīng)。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少；缺點是敏感性偏低，每檢查一種抗原就須制備一種熒光抗體，需要熒光顯微鏡，觀察結(jié)果須特殊培訓(xùn)。Litzba 等[8]報道，CHIKV IgM和IgG 在病人臨床發(fā)作3～6 d 后即可檢測到，用德國歐蒙公司生產(chǎn)的間接免疫熒光檢測試劑盒評價了在印度洋地區(qū)感染的歸國旅行者，結(jié)果顯示CHIKV IgM 抗體的特異性為93.3%、敏感性為96.9%，CHIKV IgG 抗體的特異性為100%、敏感性為95.4%。該方法是診斷CHIKV感染的較好方法。

2.2 ELISA法

ELISA 常用于病毒特異性抗原和抗體檢測，具有良好的特異性和靈敏度。任瑞文[9]等建立了檢測CHIKV的ELISA方法，經(jīng)生物信息學(xué)分析，選擇其中25 段抗原性預(yù)測得分值較高的片段，構(gòu)建原核表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)，其中11 個片段獲正確表達(dá)，用Western 印跡篩選，結(jié)果顯示CHIKV19 融合表達(dá)片段表現(xiàn)出良好的抗原反應(yīng)性及特異性，篩選的重組抗原具有良好的特異性，與所試參考多抗無交叉反應(yīng)；對鼠抗CHIKV多抗檢出范圍為1∶100～1∶12 800；對54份CHIKV 患者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陽性，與實時熒光PCR 結(jié)果相符，與登革熱患者和健康體檢人群無交叉反應(yīng)。

2.3 膠體金免疫層析法

免疫層析法是將已知抗原或抗體先包被于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，加入樣本后，在毛細(xì)管作用下，樣品沿著該膜向前移動，樣品中相應(yīng)的抗體或抗體即與包被抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合，再通過膠體金實現(xiàn)特異性的免疫診斷。目前已有相應(yīng)的CHIKV 膠體金免疫層析法商品化試劑盒，該方法操作簡單、快速，適用于快速篩查。如Onsite Chik IgM Rapid Test 試劑盒，即利用免疫層析法從患者血清中快速檢測病毒抗體IgM[10]。Chob 等報道，用C6/36 細(xì)胞培養(yǎng)CHIKV 后提取RNA，用PCR 擴(kuò)增衣殼蛋白基因，然后亞克隆到桿狀病毒載體pFastBac HT 上，構(gòu)建重組病毒，以Sf900ⅡSFM 細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生衣殼蛋白，純化后用作抗原，以膠體金標(biāo)記抗人IgM，建立膠體金免疫層析法，該膠體金免疫試紙條檢測抗CHIKV-IgM 的靈敏度為87.5%（35/40），與健康人血清、抗登革病毒陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性為100%[11]。

2.4 免疫印跡法

免疫印跡法（immunobiotting test，IBT）是凝膠電泳與抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合的一項檢測技術(shù)，具有分析容量大、分辨率高、特異性強(qiáng)等特點。IBT 包括三個步驟，首先為凝膠電泳，接著進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，最后為免疫顯色。Kowalzik等[12]用該方法對30例CHIKV陽性患者進(jìn)行檢測，22例陽性。目前該方法的臨床應(yīng)用較少。

2.5 血凝抑制試驗

某些病毒或其血凝素能使某種動物紅細(xì)胞發(fā)生凝集，當(dāng)加入足夠的特異性抗體后，抗原抗體的結(jié)合就阻止了紅細(xì)胞與該病毒或血凝素的接觸，從而抑制了紅細(xì)胞的凝集。在適宜條件下，CHIKV 能使鴿子紅細(xì)胞發(fā)生凝集[13]。Padbidri等[14]報道血凝抑制試驗具有操作簡單快速、敏感性強(qiáng)、無需特殊儀器等優(yōu)點，但因與其他病毒（如登革病毒、西尼羅病毒等）存在交叉反應(yīng)，有假陽性，致使較難分析結(jié)果。

2.6 中和試驗

中和試驗是用抗體使相應(yīng)抗原（毒素或病毒）的毒性或傳染性消失的試驗。該方法特異性高，敏感性強(qiáng)，可作為CHIK 的確診試驗，但需CHIKV 活病毒，實驗操作具有一定的危險性，且目前我國規(guī)定CHIKV 的培養(yǎng)須在BSL-3 實驗室內(nèi)進(jìn)行，因此限制了該方法的推廣及應(yīng)用[15]。

3 分子生物學(xué)檢測

與傳統(tǒng)的病毒分離法相比，分子生物學(xué)檢測方法的敏感性更高，更快速。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，RT-PCR 技術(shù)、實時熒光定量PCR 技術(shù)和LAMP 技術(shù)等都可用于病毒的檢測，目前應(yīng)用較多的有以下幾種。

3.1 RT-PCR

RT-PCR是以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，再以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增。蔡緒禹等[16]篩選了JEV、TBEV、EEEV、WEEV、CHIKV 等5 種病毒的基因保守區(qū)域作為引物，建立了多重RT-PCR，具有良好的特異性和敏感性，且可同時檢測5 種病毒，相對簡單快速。該試驗還可通過增加擴(kuò)增效率低的片段引物濃度，減少擴(kuò)增效率高的片段引物濃度等方法，有效解決了多重PCR擴(kuò)增片段大小不一導(dǎo)致的擴(kuò)增效率不平衡問題。

3.2 實時熒光PCR

實時熒光PCR具有快速、直觀、靈敏度和準(zhǔn)確度高、特異性好等特點，感染初期即可檢測出，適用于早期診斷。實時熒光PCR 與普通PCR 相比，具有所需時間更短、靈敏度更高、定量、直觀等優(yōu)點。余蓓蓓等[17]建立的同時檢測西尼羅病毒和基孔肯雅病毒的雙重?zé)晒舛縋CR，靈敏度達(dá)10 拷貝/μL,標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別達(dá)0.999、0.998，具有較高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。燕清麗等[18]建立了CHIKV的納米金實時熒光PCR 方法，較普通的實時熒光PCR 具有更高的擴(kuò)增效率，且在相同條件下，該方法的所有病毒滴度稀釋梯度的靈敏度都比普通方法提高1～3 倍，因而對低病毒載量的病原體具有更好的檢出率。Chen等[19]建立了用2，7-二氨基-1，8-二氮萘衍生物（DNAP）的發(fā)夾引物擴(kuò)增CHIKV 的NSP2 基因，該方法具有較高的敏感性，很強(qiáng)的特異性，與登革病毒和西尼羅病毒等無交叉反應(yīng)，用臨床診斷為CHIKV 感染的病人標(biāo)本進(jìn)行驗證，所有感染者檢測結(jié)果皆為陽性，特異性和敏感性都為100%。此法可用于CHIKV感染急性期的診斷。

3.3 半巢式RT-PCR

半巢式RT-PCR 是在普通PCR 的前提下，用3條引物先后擴(kuò)增靶片段的一種技術(shù)，內(nèi)外套引物共用一條上游或下游引物，在保持較好特異性和敏感性的前提下，降低了引物設(shè)計的難度和成本，繼續(xù)擴(kuò)增比普通PCR小的片段。Rianthavorn等用該方法對179例經(jīng)ELISA 法檢測IgM 抗體確診為CHIK 患者的血清進(jìn)行檢測，其中139例檢測為陽性，陽性率為77.7%。病毒血癥初期（發(fā)熱開始2～4 d）的血液樣本用半巢式RT-PCR 法檢測，結(jié)果陽性率為100%，適合CHIKV感染的早期診斷[20]。

3.4 LAMP技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是新開發(fā)的一種恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該方法針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異性引物，在63℃左右恒溫條件下，利用鏈置換DNA 聚合酶即可完成基因擴(kuò)增。由于不須改變溫度，擴(kuò)增時間短，操作簡單，不需大型儀器，適合基層醫(yī)療單位。李小波等[21]建立的基孔肯雅病毒LAMP 檢測方法，對CHIKV 的最低檢出限達(dá)到27 拷貝/反應(yīng)，其靈敏度介于普通PCR和實時熒光PCR 之間，對6 份入境患者及5 份CKIKV 樣本的檢測結(jié)果均為陽性，而對乙腦病毒、登革病毒等的檢測結(jié)果均為陰性，說明該方法具有良好的特異性及靈敏度。

3.5 RIDA技術(shù)

核酸快速等溫放大檢測（rapid isothermal detection and amplification，RIDA）技術(shù)是由李翔等[22]發(fā)明的一種新的核酸等溫檢測技術(shù)，具有以下優(yōu)點：①在同一個溫度條件下完成反應(yīng)，避免了使用價格昂貴的PCR溫度循環(huán)儀，沒有條件限制，可以普遍使用；②通過設(shè)計合成特殊結(jié)構(gòu)的檢測探針，以便分離檢測，消除背景干擾，具有很好的特異性；③不需要DNA 聚合酶等復(fù)雜酶及反應(yīng)體系，反應(yīng)體系簡單；④快速，5～10 min 完成反應(yīng)，20～30 min 完成檢測并得到結(jié)果；⑤可同時檢測多種不同目標(biāo)序列，可用于病毒的分型；⑥可同時檢測DNA 及RNA；⑦原理簡單，易于推廣應(yīng)用。但據(jù)研究顯示，該方法的靈敏度相對較低。

3.6 NASBA方法

依賴核酸序列的擴(kuò)增（nucleic acid sequencebased amplification，NASBA)技術(shù)是一項以RNA為模板進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增的檢測方法，該方法由一對引物介導(dǎo)，進(jìn)行連續(xù)均一的核酸擴(kuò)增。相對于逆轉(zhuǎn)錄PCR，NASBA可以在相對恒溫的條件下進(jìn)行，更為穩(wěn)定、準(zhǔn)確。Telles 等以CHIKV E1 基因設(shè)計的RTNASBA，對250例陰性標(biāo)本和252例陽性標(biāo)本的檢測結(jié)果與RT-PCR一致[23]。

4 結(jié)語

基孔肯雅熱目前雖仍主要在非洲、東南亞和印度洋等地區(qū)流行，但隨著全球化的進(jìn)展，我國又具備CHIKV 的傳播條件，CHIKV 一旦被攜帶傳入，就很有可能在我國引起流行。由于我國目前很少有人感染CHIKV，人群對其的免疫力普遍低，增加了基孔肯雅熱流行的風(fēng)險，疫情一旦暴發(fā)，必將給我國帶來嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題及巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，必須提前做好防控措施，而研發(fā)早期有效的檢測診斷技術(shù)顯得極其重要。目前適于早期診斷CHIKV 的檢測方法主要為分子生物學(xué)法，該方法快速、準(zhǔn)確，靈敏度高。

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