睪丸細胞生物學研究進展

祝輝，崔毓桂，周作民

（1．南京醫(yī)科大學生殖醫(yī)學國家重點實驗室；2．南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，南京210029）

睪丸是男性生殖腺，能產(chǎn)生精子和分泌雄激素。成人睪丸長約4．5cm，寬約2．5cm，厚約3．0cm，重約12g。睪丸實質(zhì)被睪丸小隔分成200～300個睪丸小葉，每個睪丸小葉含1～4條曲細精管，管腔的周圍為結(jié)締組織構(gòu)成的間質(zhì)。曲細精管主要由生精細胞和支持細胞（Sertoli cell）組成，是精子發(fā)生場所；間質(zhì)中主要含間質(zhì)細胞（Leydig cell），合成與分泌雄激素［1－2］。睪丸功能依賴生精細胞、支持細胞和間質(zhì)細胞的正常發(fā)育分化，從而形成正常的細胞結(jié)構(gòu)，并在特定時期有序地表達相關(guān)基因／蛋白質(zhì)，以保證精子生成和雄激素分泌。本文簡介睪丸細胞的發(fā)育分化，著重睪丸細胞的生物學研究進展。

一、睪丸細胞的分化和發(fā)育

1．生精細胞的分化：生精細胞由原始生殖細胞（PGCs）分化而來［3－4］。關(guān)于人 PGCs分化發(fā)育的研究較少，報道顯示：人胚第7～9周時很多生殖細胞已具有生殖母細胞（性原細胞，gonocyte）表型；18周時分化為前精原細胞（prespermatogonia）［5－6］；隨著曲細精管的形成，早期散在于睪丸索中央或周邊的生殖細胞逐漸移位于管壁上皮細胞基底部，24周后顯示出精原細胞（spermatogonia）的特征［7］。對小鼠PGCs分化的研究顯示：出生后第1天的小鼠睪丸，大多數(shù)PGCs仍在索中央，但部分PGCs遷向基膜，此時的生殖細胞可稱為生殖母細胞；至出生后第6天，生殖細胞絕大部分遷移至基膜，分化形成原始A型精原細胞（primitive type A spermatogonia）；出生后第8天，生精上皮中可見到A型精原細胞（type A spermatogonia）和B型精原細胞（type B spermatogonia）；此后直至青春期時，精原細胞才分化形成精母細胞，經(jīng)過減數(shù)分裂和分化變形，最終生成精子［8－9］。

2．支持細胞的分化：在PGCs發(fā)育分化的同時，來源于初級性索的支持細胞也逐漸分化形成，此時的細胞有不規(guī)則的細胞核和突出的核仁。在胎兒睪丸中，支持細胞占據(jù)生精上皮的大部分。但從人胚20周至32周，支持細胞與生殖細胞之比約從3∶1減少為2∶1。至新生兒期，僅有少數(shù)支持細胞，核呈三角形著色深，胞質(zhì)內(nèi)可見少許張力原纖維，仍不具備性成熟期支持細胞的典型結(jié)構(gòu)［7，10］。此后直至青春期前，關(guān)于人支持細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究很少。在小鼠，出生后第1天，支持細胞多為長橢圓形，核仁明顯，核膜可見有異染色質(zhì)附著；出生后第10天，支持細胞胞體向索中明顯突出，核色淺不規(guī)則，明顯可見核仁；大約在出生后第15天青春期開始時，曲細精管管腔開始形成，支持細胞呈現(xiàn)成熟期的典型結(jié)構(gòu)［10］。

3．間質(zhì)細胞的分化：分散在曲細精管之間的間充質(zhì)細胞分化為間質(zhì)細胞。在哺乳動物，間質(zhì)細胞分為形態(tài)和生化特征不同的兩個類群：胚胎間質(zhì)細胞（FLCs）和成年間質(zhì)細胞（ALCs）。人胚胎期，其間質(zhì)細胞前體（分化前型）在孕6～7周開始功能激活；孕7周以后間質(zhì)細胞逐漸增殖分化，胞質(zhì)中滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體開始增加，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少；孕19周后間質(zhì)細胞變性退化。研究顯示：人胚7～14周，間質(zhì)細胞處于分化階段，細胞發(fā)育為分化型；14～18周，間質(zhì)細胞處于成熟發(fā)育階段，細胞轉(zhuǎn)化為成熟型，具有旺盛的合成分泌雄激素能力，形成胚胎時期雄激素的分泌高峰；人胚13～16周時，間質(zhì)細胞數(shù)量最多，占睪丸體積一半以上［11－12］。ALCs不是來源于已有的FLCs，而可能來源于未分化的管周樣干細胞（Leydig干細胞）。在大鼠的研究顯示，Leydig干細胞出生后開始增殖，出生后14d轉(zhuǎn)化為紡錘形的前體Leydig細胞；前體細胞短暫存在于14～28d間，在這個時期細胞逐漸增殖轉(zhuǎn)化為未成熟Leydig細胞，胞質(zhì)中含有大量脂滴；未成熟Leydig細胞經(jīng)過1～2次分裂及進一步分化，出生后56d形成成熟的ALCs，胞質(zhì)中脂滴減少，黃體生成素（LH）受體增多［13］。

二、生精細胞的細胞生物學

1．精原細胞：精原細胞位于生精上皮基膜。對大鼠和小鼠精原細胞的研究較多，其細胞類型和生化表型與人精原細胞有所不同。小鼠精原細胞分為A型精原細胞，中間型精原細胞（intermediat spermatogonia）和B型精原細胞；A型精原細胞又分為未分化和分化型兩大類。未分化A型精原細胞包括 A-single（As）、A-pair（Apr）和 A-aligned（Aal）細胞，As是單個存在的精原細胞，分裂增殖產(chǎn)生2個通過胞質(zhì)橋相連的Apr細胞，Apr細胞進一步分裂形成4、8、16個成鏈狀排列的Aal細胞。這些未分化精原細胞（主要是Aal細胞）進而增殖分化生成A1、A2、A3、A4細胞，它們屬于分化的A型精原細胞。分化的A型精原細胞分裂分化生成中間型精原細胞、B型精原細胞［14］。早先的研究中，一般將未分化的A型精原細胞認為是小鼠的精原干細胞（SSCs），現(xiàn)在研究表明只有As細胞是SSCs，并且可能并不是所有As細胞均具有干細胞特征［14－15］。

哺乳動物的精子發(fā)生是經(jīng)典的干細胞依賴過程，SSCs經(jīng)自我增殖和分化最終形成精子。因此，研究SSCs增殖和分化的機制已成為生殖領(lǐng)域的重要課題，是深入揭示精子發(fā)生機制和診治雄性不育的重要途徑。借助基因敲除、精原細胞移植技術(shù)、SSCs體外培養(yǎng)等研究平臺，國內(nèi)外對小鼠SSCs增殖分化機制的研究已取得一定進展，證實了一系列生長因子（如 GDNF、FGF2）、信號通路（如PI3KAkt通路、MEK 通路）、轉(zhuǎn)錄因子（如 Plzf、Etv5、Bcl6b）、MicroRNAs（miRs）以及細胞所處微環(huán)境（如黏附分子、干細胞龕）在其中的作用［14－16］，但完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全闡明。值得注意的是，已有研究顯示小鼠和人的精原干細胞有不同的表面標記物［17］，它們分化為精母細胞的分子機理可能也存在著差異。

2．初級精母細胞：由B型精原細胞分裂形成的初級精母細胞處于分裂間期，稱細線前期精母細胞，其結(jié)構(gòu)特點與B型精原細胞相似。間期的初級精母細胞停留時間很短，立即進入分裂期，此時的初級精母細胞內(nèi)細胞器增多，高爾基復(fù)合體發(fā)達，線粒體逐漸變成泡狀線粒體，胞質(zhì)密度高于精原細胞。由于分裂前期較長，達22d，所以在切片上可以看到大量處于分裂前期各階段的初級精母細胞，根據(jù)它們的細胞核和染色體形態(tài)特征不同，可分為細線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期［1－2，18］。

初級精母細胞是啟動減數(shù)分裂的時期，這是配子發(fā)生的第一個關(guān)鍵步驟，闡明其調(diào)控機制是生殖生物學研究的核心內(nèi)容。在哺乳動物中，減數(shù)分裂啟動機制的研究大多在胚胎期進行，研究顯示減數(shù)分裂啟動需要內(nèi)在與外在兩方面條件：外源條件主要是視黃酸（RA）降解酶CYP26b1介導(dǎo)的水平；內(nèi)在條件為原始生殖細胞在特定時期表達DAZL蛋白，從而使細胞具備響應(yīng)RA的能力，保證了Stra8、Dmc1、Scp3等減數(shù)分裂相關(guān)基因的正常表達［19］。在雌性小鼠胚胎卵巢內(nèi)，CYP26b1的水平低下，保證高水平的RA作用于生殖細胞，誘導(dǎo)Stra8表達而啟動減數(shù)分裂。而雄性小鼠胚胎睪丸中CYP26b1高表達，RA水平低下，抑制Stra8表達，使生殖細胞阻滯于有絲分裂G0／G1期；至出生后青春期，睪丸中Stra8表達，啟動減數(shù)分裂［20］。然而，近來有研究顯示Stra8的表達不依賴CYP26b1介導(dǎo)的RA水平［21］，RA在減數(shù)分裂起始過程中的作用受到質(zhì)疑。因此，減數(shù)分裂的啟動受哪些因子調(diào)控以及如何調(diào)控，仍是迫切需要解決的問題。

3．次級精母細胞：初級精母細胞完成第一次減數(shù)分裂，形成兩個體積較小的次級精母細胞（secondary spermatocyte）。次級精母細胞更靠近管腔，具有均質(zhì)狀的圓形核，染色質(zhì)呈細網(wǎng)狀，并有一些大而深染的環(huán)形塊［1－2］。次級精母細胞存在的時期短，在組織切片中不易見到。

4．精子細胞：次級精母細胞完成第二次減數(shù)分裂，形成精子細胞（spermatid）。根據(jù)精子細胞發(fā)育的成熟程度及形態(tài)學特點，可分為圓形精子細胞（round spermatid，RS）和長形精子細胞（elongated spermatid，ES）。精子細胞經(jīng)核的濃縮和核蛋白轉(zhuǎn)型、頂體形成、尾部形成、多余胞質(zhì)的丟失等一系列復(fù)雜而有序的過程，轉(zhuǎn)變?yōu)榫樱╯permatozoon），稱為精子變形（spermiogenesis）。由于單倍體細胞的特殊性，對于精子變形的研究，以往主要借助于亞細胞結(jié)構(gòu)觀察、超微結(jié)構(gòu)觀察、免疫細胞化學等形態(tài)學手段，研究顯示一些特異的亞細胞結(jié)構(gòu)可能參與精子變形的各種生物學事件。如高爾基體分泌產(chǎn)生的囊泡參與頂體形成，隨著精子細胞核的濃縮變長，高爾基體不斷產(chǎn)生囊泡與之融合，呈扁平狀覆蓋在細胞核表面，逐漸包繞精子細胞核的大半部形成頂體［22］；頂漿復(fù)合物位于精子頂體與核之間，能穩(wěn)定頂體并將其錨定在精子核上，同時作為骨架提供一定的機械應(yīng)力來調(diào)節(jié)外力對核的拉伸作用［23］；精子頸帶是正在變形的長形精子細胞特有的一種微管結(jié)構(gòu)，一方面它與頂體、頂漿一起形成頂體－頂漿－頸帶復(fù)合物，參與核的濃縮與變形，此外還參與精子尾部以及殘余體的形成［24］。近年來，隨著基因敲除以及各種高通量技術(shù)的應(yīng)用，逐漸在分子水平揭示精子變形的機制，特異的基因／蛋白質(zhì)及其之間的相互作用被證實參與精子變形的各個生物學事件［25］。

5．精子：人類精子是男性生殖細胞系發(fā)育的終端產(chǎn)物，它最終通過與卵細胞融合完成受精，將父輩的遺傳信息傳遞給后代。在附睪分泌蛋白的作用下，大量的精子功能蛋白發(fā)生修飾加工，如磷酸化、糖基化、酯化、?；?、羧基化，使精子逐步獲得各項功能［26］。目前對精子功能的研究，除揭示精子特異基因的表達種類、時空和表達量變化外，其蛋白本身的修飾及調(diào)控也是非常重要的內(nèi)容。事實上，精子特殊功能發(fā)揮的背后存在著非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，絕不是一個或幾個基因／蛋白所能控制。近年來，高通量的轉(zhuǎn)錄組以及蛋白質(zhì)組學技術(shù)已應(yīng)用于精子功能及其調(diào)控的研究［26－28］，這為全面揭示精子功能提供了基礎(chǔ)。

三、支持細胞的細胞生物學

1．支持細胞（Sertoli細胞）形態(tài)結(jié)構(gòu)：成熟型支持細胞形狀復(fù)雜，在光鏡下甚至不能看清楚其細胞輪廓，近年的電鏡研究有一些新進展。支持細胞基部緊貼基膜，頂部伸達管腔，側(cè)面和腔面伸出許多不規(guī)則突起，包圍著各級生精細胞。支持細胞核大，核表面有一至數(shù)個較深的凹陷，核孔多，核質(zhì)均質(zhì)狀，異染色質(zhì)稀疏，核仁發(fā)達［2，29］。支持細胞胞質(zhì)的電子密度較高，含有各種細胞器：（1）大量細長形的線粒體，基質(zhì)致密。（2）發(fā)達的高爾基復(fù)合體，位于核附近，由平行的池及小囊泡組成。（3）呈管狀的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，主要分布在細胞基部。（4）細胞基部的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)常聚集在脂滴周圍，形成同心圓狀結(jié)構(gòu)；在圍繞精子頭的細胞頂部胞質(zhì)中，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平行排列，形成表面小池，可能與精子的排放有關(guān)。（5）溶酶體系統(tǒng)的組成成分多樣化，與支持細胞降解和處理精子殘余胞質(zhì)的功能相關(guān)。（6）含微絲和微管成分，它們是支持細胞的骨架，是細胞形狀主動改變的基礎(chǔ)，保證生精細胞在生精上皮中逐步上升以及精子的排放；其中，在細胞頂部凹陷深處的平行微絲束，是在精子細胞核濃縮的過程中形成的，可能是維持精子細胞附著于支持細胞的一種特殊裝置［2，29］。除各種細胞器外，在支持細胞頂端胞質(zhì)中常可見精子殘余體；基部胞質(zhì)中則含有脂滴、糖原等內(nèi)含物，脂滴的含量和支持細胞的功能狀態(tài)有關(guān)，在精子排放后其含量增多，可能是從吞噬的殘余體轉(zhuǎn)化而來，隨后脂滴逐漸減少［2，29］。

2．支持細胞的連接結(jié)構(gòu)：相鄰支持細胞以及支持細胞－生精細胞接觸面的連接結(jié)構(gòu)，是支持細胞行使功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，主要分為三類：緊密連接（tight junction，TJ）、錨定連接（anchoring junction）和縫隙連接（gap junction，GJ）［30］。緊密連接是相鄰支持細胞基部細胞膜間形成的連接結(jié)構(gòu)，電鏡下呈點狀、斑狀或帶狀，由閉鎖蛋白（occludins）、緊密連接蛋白（claudins）、連接黏附分子（junctional adhesion molecules，JAMs）等構(gòu)成，迄今報道的緊密連接相關(guān)蛋白已有100多種，這些蛋白在細胞間連接和細胞能動性方面發(fā)揮重要作用［30－31］。支持細胞間形成的緊密連接是血－睪屏障（blood-testis barrier，BTB）的主要組成部分，將生精上皮分隔成基底室（basal compartment）和近腔室（adluminal compartment），基底室有精原細胞和細線前期精母細胞，近腔室有較晚期初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和精子［30－31］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，精子發(fā)生過程中支持細胞緊密連接的重建可能直接或間接地與生殖細胞發(fā)育過程及生殖細胞穿過BTB有密切聯(lián)系。因此，研究緊密連接的重建對今后探索精子發(fā)生機制有極為重要的意義。錨定連接包括黏附連接（adheren junction，AJ）、細 胞 外 質(zhì) 特 化 （ectoplasmic specialization，ES）、管狀復(fù)合物（tubulobulbar complex，TBC）、橋粒以及半橋粒五種連接結(jié)構(gòu)，參與組成BTB［30］?？p隙連接由相鄰細胞膜上的GJ蛋白半通道對接形成，是支持細胞間以及支持細胞－生精細胞間的化學信號通道，參與異質(zhì)細胞間的電子代謝作用，使相鄰細胞活動同步，對精子發(fā)生過程中的同期化現(xiàn)象具有重要作用［32］。

3．BTB：存在于曲細精管與睪丸間質(zhì)的血管之間，由以下幾部分組成：（1）毛細血管內(nèi)皮及基膜；（2）間質(zhì)的結(jié)締組織；（3）生精上皮基膜；（4）支持細胞間的連接結(jié)構(gòu)。BTB中的細胞連接可有多種不同的連接方式，包括TJ、基底TBC、基底ES、橋粒和縫隙連接。其中，具有周期性重建作用的TJ是構(gòu)成BTB最為重要的組成成分，對血液中各種物質(zhì)的通透性選擇性很強，是屏障中最不易通過的結(jié)構(gòu)，而BTB的有序開放是精子生成的保證［30，33］。BTB的一個重要功能是形成并維持有利于精子發(fā)生的微環(huán)境；另一方面，BTB還是一道有效的免疫屏障，使精母細胞和精子抗原不能與體內(nèi)的免疫系統(tǒng)接觸，因而可避免生精細胞自身免疫反應(yīng)發(fā)生。

四、間質(zhì)細胞的細胞生物學

出生后，ALCs逐漸開始增殖分化，青春期后分化為成熟的ALCs。成熟ALCs呈多角形或球形，直徑約為15～20μm；核圓居中；胞質(zhì)嗜酸性強，含豐富的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、管狀嵴線粒體和脂滴［1－2］。間質(zhì)細胞的主要功能是合成和分泌雄激素。胞質(zhì)中的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含豐富的膽固醇酯酶，能催化由血中攝取的脂肪酸和膽固醇形成酯化膽固醇并儲存在脂滴中。脂滴周圍含有可溶性酯酶，可催化脂滴中的膽固醇酯釋放出游離的膽固醇作為合成類固醇的原料。合成雄激素功能活躍的Leydig細胞利用脂滴中的物質(zhì)比較快，脂滴減少，體積變??；反之，合成雄激素功能不活躍的間質(zhì)細胞，脂滴多，體積也大。因此脂滴的多少，在一定程度上可作為衡量間質(zhì)細胞功能的一個形態(tài)學指標。脂滴釋放的膽固醇快速轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)膜，經(jīng)線粒體酶的作用轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，此后在滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酶的作用下再轉(zhuǎn)化為睪酮。成年期時睪酮分泌穩(wěn)定，以維持精子發(fā)生、男性第二性征和性功能；睪酮還能促進蛋白質(zhì)合成、骨骺融合，并刺激骨髓造血，此外對機體免疫功能也有調(diào)節(jié)作用［1－2］。近年研究顯示，間質(zhì)細胞還能合成和分泌多種生長因子和生物活性物質(zhì)，參與睪丸功能及骨代謝的調(diào)節(jié)［34］。

近年來，借助于核磁共振、透射電鏡、免疫電鏡、激光共聚焦顯微鏡等先進儀器和技術(shù)，睪丸細胞生物學領(lǐng)域的研究仍大有可為，如支持細胞的構(gòu)象、支持細胞與生精細胞的連接結(jié)構(gòu)、精子發(fā)生和精子形成。此外，高通量技術(shù)在男性生殖研究中的應(yīng)用，將有助于全面、深入地在分子水平理解精子發(fā)生和精子功能的生物學過程及調(diào)控。

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