奶粉中蛋白質(zhì)檢測方法的研究*

汪菊付大友 徐晨曦

（四川理工學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，四川自貢643000）

奶粉中蛋白質(zhì)檢測方法的研究*

汪菊**付大友 徐晨曦

（四川理工學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，四川自貢643000）

蛋白質(zhì)是奶粉的主要成分，也是奶粉質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。綜述了奶粉中蛋白質(zhì)檢測方法，包括凱氏定氮法、紫外可見分光光度法、近紅外光譜法等，并對(duì)這些檢測方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)等進(jìn)行介紹，為奶粉中蛋白質(zhì)檢測方法的選擇及改進(jìn)提供理論依據(jù)。

奶粉；蛋白質(zhì)；檢測方法

近年來，雖然液態(tài)奶得到迅速發(fā)展，但由于奶粉的功能及其配方具有獨(dú)特的特點(diǎn)，至今仍然是人們熱愛的食品之一。評(píng)價(jià)奶粉營養(yǎng)價(jià)值和質(zhì)量的首要指標(biāo)就是蛋白質(zhì)的含量高低。人類生命活動(dòng)的基礎(chǔ)物質(zhì)是蛋白質(zhì)，它是人類最重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，也是構(gòu)成人體新生組織、維持人體健康的主要成分，它還具有許許多多生物學(xué)功能：酶的催化作用；激素的生理調(diào)節(jié)作用；血紅蛋白的運(yùn)載作用；肌纖凝蛋白的收縮作用；機(jī)體的免疫作用和膠原蛋白的支架作用等，給人們提供了很多信息。

目前市場上劣質(zhì)奶粉給人們身體健康帶來巨大的傷害，此問題也引起相關(guān)政府部門的高度重視。如果長期食用劣質(zhì)奶粉會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)不良、免疫力下降，會(huì)引發(fā)多種疾病從而導(dǎo)致死亡。因此，尋找一種快速、簡單地檢測奶粉中蛋白質(zhì)的質(zhì)量方法是十分重要的。

1 研究方法

奶粉中蛋白質(zhì)的量是衡量奶粉質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，也是國家要求各企業(yè)必須提供的值。目前測定奶粉中蛋白質(zhì)的方法有以下幾種：國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法凱氏（Kiel Dahl）定氮法、紫外吸收法、雙縮脲法（Biuret法）、福林-酚試劑法（Lowry法）、考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）、近紅外光譜法（NIRS法）等。

1.1 凱氏定氮法

國內(nèi)外檢測奶粉中蛋白質(zhì)含量經(jīng)典的分析方法是凱氏定氮法，它的應(yīng)用較為普遍，主要分為消化、蒸餾、吸收和滴定4個(gè)階段，其中消化過程所需時(shí)間過長。Domini等采用微波和超聲輔助消化，其中經(jīng)典凱氏定氮法消化時(shí)間為30 min、超聲輔助用時(shí)25 min、微波-超聲輔助用時(shí)7 min。凱氏定氮法的工作原理是在催化劑的作用下，濃硫酸破壞樣品中有機(jī)物，將其有機(jī)氮全部轉(zhuǎn)化為氨，再與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨，然后加入強(qiáng)堿進(jìn)行蒸餾使氨逸出，用硼酸吸收，鹽酸滴定，測定出含氮量，最后乘以換算系數(shù)，計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。此方法分為常量凱氏定氮法、微量凱氏定氮法及改良凱氏定氮法（催化劑中增加Ti02）。

凱氏定氮法對(duì)檢測總有機(jī)氮含量較準(zhǔn)確，適用范圍廣泛。但凱氏定氮法操作過程繁瑣、操作時(shí)間長（長達(dá)2 h～4 h）、樣品易被損壞，在樣品與硫酸共熱過程中，有一定的危險(xiǎn)性，并且產(chǎn)生大量的有害氣體。一些生產(chǎn)商為獲取利益，在奶粉生產(chǎn)過程中非法添加三聚氰胺、尿素、化肥、水解蛋白等非蛋白質(zhì)氮，由于凱氏定氮法測定的是總有機(jī)氮含量，不能夠區(qū)分蛋白質(zhì)氮和非蛋白質(zhì)氮，使得食品安全事件屢次發(fā)生。

1.2 紫外可見分光光度法

1.2.1 紫外吸收

蛋白質(zhì)中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，從而使蛋白質(zhì)在波長為280 nm處對(duì)紫外光有吸收，其吸光度值與蛋白質(zhì)的含量成正比關(guān)系。并且蛋白質(zhì)溶液在波長為238 nm下所測得的吸光度值與肽鍵含量也成正比。在一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的吸光度與蛋白質(zhì)濃度成正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。

紫外吸收具有操作簡單、靈敏、快速的優(yōu)點(diǎn)，但是在測定蛋白質(zhì)的過程中卻有大量的干擾物質(zhì)（如嘌呤、嘧啶及核酸等）存在；溶液的pH對(duì)其蛋白質(zhì)的吸收峰有一定的影響，吸收峰會(huì)因pH的改變而變化，此方法最主要目的是對(duì)紫外吸收原理及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性有一定的了解。

1.2.2 雙縮脲法

雙縮脲法是測定乳蛋白的另一種方法。在180℃左右將兩分子脲進(jìn)行加熱，釋放出一分子氨從而獲得雙縮脲產(chǎn)物。它的原理是在堿性作用下，含有肽鍵的化合物與硫酸銅中的銅離子結(jié)合生成紫紅色絡(luò)合物，稱其為雙縮脲反應(yīng)。凡是含有2個(gè)酰胺基或2個(gè)直接相連的肽鍵或間隔1個(gè)碳原子相連的肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物都會(huì)發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)的濃度與紫色絡(luò)合物顏色的深淺成正比，在波長為540 nm下所測定的吸光度值從而得出蛋白質(zhì)的含量，而且蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸成分對(duì)其無影響。

雙縮脲法可將非蛋白質(zhì)氮和蛋白質(zhì)氮較好的分離，排除了多種非蛋白質(zhì)氮（如三聚氰胺）對(duì)檢測奶粉中蛋白質(zhì)含量的影響，得到一個(gè)較為滿意的結(jié)果。但是此方法存在一些干擾物質(zhì)（主要是三羥甲基氨基甲烷）使其靈敏度下降，因而只適合于快速但不精確的蛋白質(zhì)檢測。

1.2.3 福林-酚試劑法

福林-酚試劑法最早是由Lowry確定蛋白質(zhì)檢測的有關(guān)操作。此方法中樣品的吸光度值依賴于部分氨基酸的濃度和四肽的結(jié)合，這是因它們能減少福林-酚試劑的還原性。

福林-酚試劑法的顯色原理是以雙縮脲法為前提，加入一種加深顯色的試劑，即福林-酚試劑，從而使得蛋白質(zhì)檢測的靈敏度提高。顯色量增強(qiáng)的原因是：蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基將福林-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽還原，產(chǎn)生深藍(lán)色混合物——鉬藍(lán)和鎢藍(lán)。在一定條件下，顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比。

此方法優(yōu)點(diǎn)是比Biuret法的靈敏度高，缺點(diǎn)是必須嚴(yán)格控制操作時(shí)間，比較費(fèi)時(shí)；干擾物質(zhì)（如甘氨酸等）大量存在；標(biāo)準(zhǔn)曲線為不嚴(yán)格直線，專一性差。不同的蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸，顏色深淺就會(huì)隨蛋白質(zhì)不同而變化。因此，此法普遍只用于檢測蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度。

在雙縮脲反應(yīng)中產(chǎn)生的干擾離子反應(yīng)也會(huì)對(duì)福林-酚反應(yīng)引起干擾，并且對(duì)福林-酚反應(yīng)影響更大。濃度較低的硫酸鈉、硝酸鈉、丙酮等溶液對(duì)顯色無影響，但是這些溶液的濃度較高時(shí)，就必須作校正曲線。僅需加入碳酸鈉-氫氧化鈉溶液就可以顯色測定。如果試樣的酸性較高，顯色較淺，這時(shí)就必須提高碳酸鈉-氫氧化鈉溶液的濃度1～2倍。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)檢測過程中，福林-酚試劑加入時(shí)要十分小心，因此試劑只能在酸性條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)又只能在pH=10的條件下發(fā)生，因此將福林-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立刻混勻，為了在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)能夠發(fā)生。

1.2.4 考馬斯亮藍(lán)法

Bradford在1976年建立了考馬斯亮藍(lán)法，它是根據(jù)染料與蛋白質(zhì)相結(jié)合的原理進(jìn)行的。此法檢測蛋白質(zhì)有它獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，因而應(yīng)用較廣泛。目前，Bradford法是蛋白質(zhì)測定方法中靈敏度最高的。

考馬斯亮藍(lán)G-250染料存在著棕紅色和藍(lán)色兩種形式。在酸性條件下，考馬斯亮藍(lán)G-250染料通過范德華力與蛋白質(zhì)相結(jié)合，使它的最大吸收峰的波長由465 nm變?yōu)?95 nm，并且溶液的顏色也由棕紅色變?yōu)榱怂{(lán)色。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，考馬斯亮藍(lán)G-250染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在10 μg/mL～1000 μg/mL時(shí)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律，從而得到與其蛋白質(zhì)結(jié)合的含量。

蛋白質(zhì)與染料結(jié)合大約2 min就能反應(yīng)完全，此反應(yīng)很快，出現(xiàn)最大光吸收，大約穩(wěn)定1 h后，蛋白質(zhì)與染料所形成的復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來。此復(fù)合物具有相當(dāng)高的消光系數(shù)，使得在蛋白質(zhì)檢測過程中具有很高的靈敏度。

考馬斯亮藍(lán)法優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高。比福林-酚法的靈敏度約強(qiáng)4倍，且最低蛋白質(zhì)檢測含量可達(dá)10 μg。②快速、簡便、所需試劑少。大約5 min就能完成一個(gè)樣品的測定，染料與蛋白質(zhì)結(jié)合大約2 min所形成的化合物顯色最穩(wěn)定，不需要像福林-酚法那么費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。③干擾物質(zhì)少。Anjalie等研究發(fā)現(xiàn)考馬斯亮藍(lán)法可以很容易、方便地檢測出所有食品中的蛋白質(zhì)含量，在再生乳粉中蛋白質(zhì)含量檢測時(shí)，并無三聚氰胺和三聚氰酸的干擾。

考馬斯亮藍(lán)法缺點(diǎn)：①考馬斯亮藍(lán)法用來檢測不同蛋白質(zhì)含量時(shí)有較為明顯的偏差，這是因?yàn)椴煌鞍踪|(zhì)中所含的精氨酸和芳香族氨基酸的量不同，在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)常常選用γ-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，來降低此偏差。②去污劑、Triton X-100、十二烷基磺酸鈉（SDS）和氫氧化鈉等干擾物對(duì)其測定仍有干擾。③在蛋白質(zhì)濃度較大時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線趨向于非線性。④在測定的過程中，比色皿壁上避免不了粘有少許的復(fù)合物蛋白-染料，但此復(fù)合物的吸附量是可以忽略的，試驗(yàn)完畢后可以通過乙醇清洗掉比色皿上的污染物質(zhì)。

雖然考馬斯亮藍(lán)染色法具有靈敏度高、測定快速、簡便、干擾物少、也不需要大型儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，但是此方法只適用于準(zhǔn)確度要求不高的微量蛋白質(zhì)檢測。

1.3 近紅外光譜法

近年來，近紅外光譜法的發(fā)展迅猛，尤其是在新型定量、定性分析技術(shù)上。近紅外光譜與有機(jī)物中含氫基團(tuán)（如C-H、O-H、N-H、S-H等）振動(dòng)的合頻與倍頻的吸收一致，因而只需掃描試樣的近紅外光譜就可以很方便地得到試樣中有機(jī)分子中含氫基團(tuán)的特征信息。

由于在近紅外光譜區(qū)中有機(jī)物主要為倍頻和合頻吸收，因此譜峰重疊性嚴(yán)重，此時(shí)具有較弱的消光系數(shù)。為了解決譜峰重疊與測量信息高背景低強(qiáng)度，后來人們發(fā)現(xiàn)了可以使用化學(xué)計(jì)量的辦法進(jìn)行消除此等問題。在NIR中，由于樣品的組成和結(jié)構(gòu)與近紅外光譜存在一定的函數(shù)關(guān)系。然后，通過使用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法來確定出此函數(shù)關(guān)系、校正，就可以根據(jù)所測的近紅外譜圖快速計(jì)算出各種數(shù)據(jù)。

儀器測量信號(hào)的數(shù)字化與分析過程的綠色化程度不斷提高，從而使得此技術(shù)具有以下幾個(gè)方面特點(diǎn)：①分析對(duì)象廣，所有與含氫基團(tuán)有關(guān)的有機(jī)物質(zhì)都可以用此法進(jìn)行分析。②吸收強(qiáng)度低，穿透能力強(qiáng)，分析樣品的外形要求不高，樣品制備也簡單。③適用于漫反射技術(shù)。④近紅外光可以穿透玻璃或石英介質(zhì)。⑤分析快速、簡便，大約1 min就能完成一個(gè)樣。⑥對(duì)樣品無損壞和無污染，并且不需要加入任何溶劑。⑦可以檢測試樣物理信息。⑧重現(xiàn)性好，效率高，該方法的一個(gè)最主要特性是它本身的成套性（近紅外光譜儀、化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件和應(yīng)用模型的三位一體性），該技術(shù)的基礎(chǔ)和前提是性能好的近紅外光譜儀。

當(dāng)然近紅外光譜分析技術(shù)也存在著一定的局限性：①首先，近紅外光譜分析需要用一個(gè)相似的試樣建立一個(gè)穩(wěn)定模型才能夠快速得到分析結(jié)果，但是它需要一定的人力、財(cái)力和時(shí)間才能完成模型的建立。②在近紅外區(qū)范圍內(nèi)，物質(zhì)吸收系數(shù)較小，檢測限常在100×10-6，因而不適用對(duì)痕量物質(zhì)進(jìn)行分析。

1.4 其他檢測方法

1.4.1 杜馬斯定氮法

引起試樣的完全裂解并測定燃燒氣體中氮含量稱為杜馬斯定氮法。在高溫（900℃）室內(nèi)燃燒已知量的樣品，釋放出二氧化碳、水和氮，然后將所釋放出來的氣體通過特殊的柱子除掉，此時(shí)氮?jiǎng)t通過另一根柱子分離開來，再使用氦氣作為載氣的熱導(dǎo)檢測器進(jìn)行檢測。此方法所需樣品的量一般在5 mg～50 mg范圍內(nèi)，測定快速，測定結(jié)果也很準(zhǔn)確。Hakoda等在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究，分別以日本農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（JAS）和凱氏定氮法評(píng)定燃燒法來測定通心粉制品粗蛋白的重現(xiàn)性，在測試材料上兩者的差異是0.10%～0.13%，但JAS的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于全自動(dòng)定氮儀。

1.4.2 電泳法

帶電粒子在電場作用下，向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。電泳法屬于物理檢測方法，蛋白質(zhì)的電泳分離是一種重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)。唐萍等通過使用毛細(xì)管電泳法來檢測奶制品中蛋白質(zhì)含量，將牛奶中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-酷蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白5種蛋白通過檸檬酸體系進(jìn)行分離，討論了緩沖液PH值和運(yùn)行電壓對(duì)蛋白質(zhì)分離的影響。此試驗(yàn)證實(shí)毛細(xì)管電泳法準(zhǔn)確、快速、無污染，并且為牛奶的質(zhì)量監(jiān)控和奶粉的配方改善作出貢獻(xiàn)。

2 小結(jié)

奶粉中蛋白質(zhì)的檢測方法有很多種，但準(zhǔn)確、快速、靈敏、低成本來檢測奶粉中蛋白質(zhì)的含量問題尚未得到解決。本文充分地總結(jié)了奶粉中蛋白質(zhì)檢測方法的相關(guān)原理及優(yōu)缺點(diǎn)，為選擇方法時(shí)，提供可靠的依據(jù)，同時(shí)也為今后研究與開發(fā)出更可靠、快速、靈敏的蛋白質(zhì)檢測方法提供一定的理論依據(jù)。

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Study on determination method ofprotein in milk powder

WANGJu FUDa-you XUChen-xi
（College ofmaterial science and chemical engineering，Sichuan universityofscience and engineering，Sichuan Zigong 643000，China）

Protein is important indicator of evaluation of milk powder.In this paper，it is discussed the detection method of protein in milk powder，the common detection methods included Kiel Dahl method，Bradford method，NIR spectroscopy and so on.The principle，advantages and disadvantages are introduced.These investigations will provide a theoretical reference for improvingand developingmethods ofprotein detection in milk powder.

milk powder；protein；determination methods

TS252.51

A

1673-6044（2014）02-0015-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2014.02.006

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（NO.13ZA0123）。

**汪菊，女，1989年出生，四川理工學(xué)院應(yīng)用化學(xué)專業(yè)在讀研究生。

2014-01-09

修回日期：2014-01-12