貴陽(yáng)貓?jiān)垂蜗x(chóng)株基因分型及毒力研究

孟德娣，王 林，樓 研，房功思，沈繼龍

剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)是一種世界性分布的專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，可感染包括人類(lèi)在內(nèi)的幾乎所有恒溫動(dòng)物，引起人獸共患弓形蟲(chóng)病。人類(lèi)對(duì)弓形蟲(chóng)普遍易感，據(jù)估計(jì)全世界約有1/3的人感染弓形蟲(chóng)，中國(guó)人群弓形蟲(chóng)血清抗體平均陽(yáng)性率為7.88%[1]。人類(lèi)感染弓形蟲(chóng)主要通過(guò)攝入含有包囊的生的或未煮熟的肉類(lèi)，食入被卵囊污染的食物或飲水，及母嬰垂直傳播[2]。正常人群感染弓形蟲(chóng)后主要表現(xiàn)為無(wú)癥狀的隱性感染，但對(duì)免疫功能低下或缺陷者(如惡性腫瘤、器官移植及HIV感染者)，則可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，甚至導(dǎo)致致死性機(jī)會(huì)感染。

已知全球弓形蟲(chóng)基因型主要來(lái)源于6個(gè)分支進(jìn)化單位，且在不同地域具有不同的優(yōu)勢(shì)基因型[3]。在北美、歐洲弓形蟲(chóng)的基因型主要以無(wú)性系原型(archetype)克隆譜系I、II和III型為主[4-5].I型對(duì)小鼠的致死劑量為一個(gè)速殖子，屬?gòu)?qiáng)毒株；II和III型對(duì)小鼠的致死劑量超過(guò)1000個(gè)速殖子，屬弱毒株。最近報(bào)告，Type 12為流行北美野生動(dòng)物中的優(yōu)勢(shì)基因型[6]，而在南美地區(qū)，其基因型具有豐富的遺傳多樣性，主要為非典型[7]。在非洲，弓形蟲(chóng)分離株基因型主要以II型和III型為主； Africa 1型和Africa 3型也是流行于非洲的優(yōu)勢(shì)基因型[8]。我們對(duì)中國(guó)東南、中部和西部地區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國(guó)弓形蟲(chóng)分離株具有有限的遺傳多態(tài)性，且China 1型為其優(yōu)勢(shì)基因型[1,9-11]。西南地區(qū)具有豐富的遺傳多樣性，作為弓形蟲(chóng)宿主的動(dòng)物種類(lèi)較多，但該地區(qū)弓形蟲(chóng)的遺傳進(jìn)化和毒力未見(jiàn)報(bào)道。本文采用PCR-RFLP對(duì)中國(guó)西南地區(qū)(貴陽(yáng))貓?jiān)垂蜗x(chóng)株進(jìn)行基因分型，探討其與中國(guó)其他地區(qū)有無(wú)遺傳差異，以及分離株對(duì)不同品系小鼠的毒力?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和蟲(chóng)株 貓購(gòu)自于貴州貴陽(yáng)，雌雄各半，所有貓均麻醉處死，取腦組織進(jìn)行弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株分離。雌性KM，BALB/c，C57BL及ICR小鼠各10只，SPF級(jí)， 5～6 w齡，體重20±2 g，購(gòu)于安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫下自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、飲水。參考蟲(chóng)株DNA (GT1(基因I型)，PTG(基因II型)，CTG株(基因III型))由美國(guó)田納西大學(xué)蘇春雷教授惠贈(zèng)。

1.2試劑及主要儀器 DNA純化試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN 公司；PCR預(yù)混液購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶Sau96Ⅰ，HaeⅡ,Hinf I,TaqI,NciI,BsiE I,MseI,BsmA I,MboII,HpyCH4 Ⅳ,RsaI,HaeIII,NlaIII,AvaI,AflII,DdeI購(gòu)自美國(guó)Ferments公司；PCR純化試劑盒購(gòu)自杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；SAG1，SAG2，SAG3，BTUB，GRA6，c22-8，c29-2，L358，PK1，Apico引物由上海生工生物工程有限公司合成；凝膠成像系統(tǒng)為珠海Hema公司產(chǎn)品，ATC 201型 PCR 擴(kuò)增儀為美國(guó) Apollo 公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1貓?jiān)垂蜗x(chóng)的分離 采取與文獻(xiàn)報(bào)道[12]相似的方法：取貓腦組織50 g，加入125 mL無(wú)菌生理鹽水，制備形成勻漿液，加入 37 ℃預(yù)熱的鹽酸胃蛋白酶消化液，置恒溫?fù)u床中，37 ℃，150 r/min，消化1 h。離心，棄上清液，加入約 20 mL 的 PBS，用1.2%碳酸氫鈉溶液調(diào)pH為中性，離心，滅菌生理鹽水稀釋?zhuān)?氨芐西林1 000 U,鏈霉素 100 μg/mL)制成混懸液。將上述組織懸液腹腔接種KM小鼠3只，每只小鼠接種 1 mL。每d觀察，如小鼠有豎毛、弓背、厭食等明顯癥狀時(shí)，收集腹腔灌洗液涂片，鏡檢。

1.3.2弓形蟲(chóng)DNA的提取與基因分型 分別取弓形蟲(chóng)感染小鼠的腹水，PBS洗滌3次，離心收集弓形蟲(chóng)速殖子后，用QIAamp?DNA Mini kit試劑盒提取基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用蘇春雷等發(fā)表的SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1及Apico基因特異性引物[5]，以弓形蟲(chóng)參考蟲(chóng)株及本室分離株的基因組DNA為模版，擴(kuò)增上述10個(gè)基因片段，反應(yīng)總體積為50 μL，其中PCR master mix 25 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板1.5 μL。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，每管取5 μL PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠(Ethidium Bromide，EB)的1%瓊脂糖凝膠中100 V電泳30 min，并在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。然后各管余下PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后用DNA膠回收試劑盒切膠回收，純化的PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切。酶切后產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳，0.5 μg/mL溴化乙錠染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄結(jié)果。

1.3.3弓形蟲(chóng)的毒力 弓形蟲(chóng)CT-1株感染KM小鼠，待出現(xiàn)明顯癥狀后收集腹水，PBS洗滌3次后經(jīng)梯度離心法純化速殖子[1]，純化后速殖子經(jīng)PBS稀釋至2 mL置顯微鏡下計(jì)數(shù)，按1×103個(gè)/只腹腔感染SPF級(jí)KM，BALb/c，C57BL，ICR小鼠，每組10只。逐日觀察小鼠狀態(tài)并計(jì)算死亡率和存活時(shí)間，至感染后45 d頸椎脫臼處死各組存活小鼠，腦組織壓片觀察包囊是否形成。累積死亡率=死亡小鼠個(gè)數(shù)/感染小鼠個(gè)數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)不同品系的小鼠的存活時(shí)間、死亡率，采用χ2檢驗(yàn)對(duì)CT-1蟲(chóng)株感染4種品系小鼠反應(yīng)有無(wú)差異，χ2分割法對(duì)不同品系小鼠的兩兩檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1弓形蟲(chóng)基因分型 采用10個(gè)遺傳位點(diǎn)，對(duì)本室分離的2株貓?jiān)垂蜗x(chóng)株進(jìn)行基因分型，共揭示了1個(gè)基因型(ToxoDB#9, China 1)(表1)。基因型China 1型在SAG2、GRA6、L358、PKl、c22-8位點(diǎn)為基因II型；在SAG3、BTUB、c29-2位點(diǎn)為基因III型；在Apico位點(diǎn)為基因I型，圖1。

2.2小鼠毒力 BALB/c、C57BL、KM 、ICR四個(gè)品系雌鼠各10只，經(jīng)腹腔接種1×103個(gè)CT-1蟲(chóng)株速殖子。小鼠的生存時(shí)間和死亡率觀察結(jié)果見(jiàn)圖2。C57BL小鼠感染后第5天開(kāi)始出現(xiàn)豎毛、腹水、抽搐等明顯癥狀甚至死亡，第6 d完全死亡。BALB/c小鼠在第5、6、7這3 d之內(nèi)全部死亡。KM 小鼠感染后6-7 d，活動(dòng)減少，出現(xiàn)弓背、豎毛等癥狀，第10 d死亡2只小鼠，感染后第15 d至觀察45 d結(jié)束，小鼠恢復(fù)正常活動(dòng)，一直存活。ICR小鼠相對(duì)于BALB/c、C57BL小鼠癥狀輕微，在第10、14 d分別死亡了2只和1只小鼠，其余的在45 d內(nèi)存活。存活的感染小鼠45 d后頸椎脫臼處死，腦組織壓片發(fā)現(xiàn)有大量包囊形成。通過(guò)進(jìn)行不同品系小鼠毒力對(duì)比，顯示CT-1蟲(chóng)株感染C57BL、BALB/c、KM、ICR小鼠死亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，C57BL、BALB/c小鼠兩者之間及KM、ICR小鼠兩者之間對(duì)蟲(chóng)株無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。

表1 中國(guó)貴陽(yáng)2株貓?jiān)葱怨蜗x(chóng)蟲(chóng)株基因分型

Note:*unique RFLP genotypes

圖1酶切電泳圖

A：SAG2位點(diǎn) B：SAG3位點(diǎn) C：L358位點(diǎn)

Fig.1RestricteddigestionofPCRproductbyagarosegelelectrophoresis

A: SAG2; B: SAG3; C: L358; M: 700 bp marker;

I, II and III: GT1, PTG, and CTG; 1 and 2: CT-1 and CT-2.

圖2 弓形蟲(chóng)CT-1蟲(chóng)株感染不同品系小鼠的毒力

3 討 論

最近的研究顯示，流行中國(guó)的動(dòng)物源性弓形蟲(chóng)分離株具有有限的遺傳多樣性，且China 1型(ToxoDB#9)為其優(yōu)勢(shì)基因型[1,9-11]。China 1基因型在SAG2、GRA6、L358、PK1、c22-8位點(diǎn)為基因II型，在c29-2、SAG3及BTUB位點(diǎn)為基因III型，在Apico位點(diǎn)為基因I型。Dubey等[13]首先采用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)分離自中國(guó)廣東貓?jiān)垂蜗x(chóng)株進(jìn)行基因分型研究，通過(guò)擴(kuò)增10個(gè)遺傳標(biāo)記，將15個(gè)弓形蟲(chóng)株分為基因ToxoDB#9型。隨后，又有很多應(yīng)用PCR-RFLP方法對(duì)中國(guó)不同地域貓?jiān)葱怨蜗x(chóng)株進(jìn)行遺傳特性研究。本實(shí)驗(yàn)室和其他學(xué)者[1,9,14]對(duì)從中國(guó)華東(山東，江蘇，安徽)、華南(廣東)、華中(湖北)和華北(北京、山西)地區(qū)分離的54株貓?jiān)葱怨蜗x(chóng)株，在SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1和Apico等10個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行PCR-RFLP分析(見(jiàn)表2)，并結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行毒力鑒定，結(jié)果顯示所有的分離株共包含4個(gè)基因型，分別為T(mén)oxoDB#9(China 1)型(41/54)、ToxoDB#10 (Type I)型(1/54)，ToxoDB#3型(8/54)， ToxoDB#205型(4/54)。因此，China 1基因型為中國(guó)貓?jiān)葱怨蜗x(chóng)株優(yōu)勢(shì)基因型?；蛐虲hina 1亦在分離自中國(guó)不同地域的豬源及人源性弓形蟲(chóng)中亦有過(guò)報(bào)道[9-11]。 同時(shí)，China 1基因型在亞洲的越南、斯里蘭卡，南美的巴西、哥倫比亞及北美的雞源，貓?jiān)春凸吩垂蜗x(chóng)分離株中均有過(guò)報(bào)道，表明China 1基因型為中國(guó)優(yōu)勢(shì)基因型并在全球廣泛分布[2]。本研究對(duì)貴州貓?jiān)葱怨蜗x(chóng)株進(jìn)行生物與遺傳特性研究，運(yùn)用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)10個(gè)遺傳位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均為China 1型，進(jìn)一步驗(yàn)證了我國(guó)弓形蟲(chóng)株具有有限的遺傳多態(tài)性。

表2 中國(guó)各地區(qū)報(bào)道的貓?jiān)葱怨蜗x(chóng)基因型

貓科動(dòng)物是弓形蟲(chóng)生活史中唯一的終宿主，可分泌對(duì)環(huán)境有抵抗力的卵囊，污染食物，飲水和土壤，增加包括人在內(nèi)的絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物、家畜和家禽的感染，全國(guó)各地調(diào)查貓弓形蟲(chóng)感染率隨著地域差異有所變化，中國(guó)蘭州陽(yáng)性率21.3%，廣東為25.2%～79.4%，北京為14.1%～57.8%[15-16]。孕婦感染弓形蟲(chóng)可通過(guò)胎盤(pán)傳播導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)嚴(yán)重的感染甚至死亡，正常人感染弓形蟲(chóng)后通常形成無(wú)癥狀的隱性感染狀態(tài)，當(dāng)人免疫力降低時(shí)(如腫瘤患者、艾滋病及器官移植者)可引起嚴(yán)重的疾病甚至死亡。

弓形蟲(chóng)屬僅有剛地弓形蟲(chóng)一種，但來(lái)自全球各地的分離株卻具有豐富的遺傳多樣性，不同蟲(chóng)株基因有微小差異，對(duì)小鼠毒力卻存在很大差異。不同基因型的弓形蟲(chóng)感染不同活化的巨噬細(xì)胞亞群，調(diào)節(jié)不同的信號(hào)通路。已經(jīng)明確棒狀體蛋白激酶ROP16和致密顆粒蛋白GRA15都是毒力決定因子。Ⅰ型和Ⅲ型弓形蟲(chóng)的ROP16能夠組成性地磷酸化STAT6，使巨噬細(xì)胞極化為M2；而Ⅱ型弓形蟲(chóng)GRA15則活化NF-κb，誘導(dǎo)促炎癥性的M1基因表達(dá)[20]。中國(guó)優(yōu)勢(shì)基因型(China 1型)弓形蟲(chóng)株不同蟲(chóng)株對(duì)小鼠的毒力不同。王林等用China 1 型弓形蟲(chóng)株腹腔感染SW小鼠，發(fā)現(xiàn)大部分蟲(chóng)株在1周內(nèi)致死所有小鼠；但是TgCtwh6(China 1型)蟲(chóng)株感染小鼠只出現(xiàn)一過(guò)性的炎癥反應(yīng)，且感染3周后在存活小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的包囊[9]。陳兆武等用14株蟲(chóng)株感染KM小鼠，提示為China 1型弓形蟲(chóng)株強(qiáng)度株，有趣的是已經(jīng)證實(shí)為強(qiáng)毒株的TgCtys1, TgCtwh1 和 TgCtwh4感染小鼠可存活至45 d，同時(shí)腦組織中含有大量包囊[1]。錢(qián)偉鋒等用同一基因型弓形蟲(chóng)株TgCatBj2不同劑量腹腔感染BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)China 1型弓形蟲(chóng)株為中等毒力株[19]。據(jù)此推測(cè)，流行我國(guó)的優(yōu)勢(shì)基因型China 1型弓形蟲(chóng)株存在不同毒力株。目前為止，優(yōu)勢(shì)基因型China 1型弓形蟲(chóng)株感染不同品系小鼠的生存時(shí)間和死亡率鮮見(jiàn)報(bào)道，本文用CT-1蟲(chóng)株1 000個(gè)速殖子腹腔感染近交系小鼠(C57BL、BALB/c)和遠(yuǎn)交系小鼠(ICR、KM)，觀察感染小鼠的存活時(shí)間和死亡率。顯示同一蟲(chóng)株的毒力隨不同品系小鼠反應(yīng)不同，死亡率差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。近交系小鼠中C57BL、BALB/c小鼠分別在6、7 d內(nèi)全部死亡，兩者之間對(duì)蟲(chóng)株的反應(yīng)無(wú)明顯差異(P>0.01)，與李亞飛等[20]的報(bào)道相似，說(shuō)明近交系小鼠無(wú)胸腺，細(xì)胞免疫缺陷，對(duì)China 1型抵抗力低，是研究弓形蟲(chóng)急性感染的理想模型。遠(yuǎn)交系KM、ICR小鼠對(duì)CT-1蟲(chóng)株有更強(qiáng)的耐受性，存活率高，兩者之間無(wú)明顯差異，而且在腦組織中發(fā)現(xiàn)大量包囊，因此為研究弓形蟲(chóng)慢性感染的發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)特征等相關(guān)研究提供了良好的感染動(dòng)物模型。因此，用China 1基因型對(duì)不同品系小鼠的探求為后續(xù)研究提供了一個(gè)科學(xué)、適宜的小鼠感染模型。

總之，在中國(guó)西南地區(qū)弓形蟲(chóng)的基因分型及毒力研究豐富了我國(guó)弓形蟲(chóng)種群遺傳學(xué)、流行病學(xué)研究的資料，為更好地理解弓形蟲(chóng)基因型相關(guān)的致病機(jī)制具有重要意義。

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