超聲造影劑對高強(qiáng)度聚焦超聲破壞棘球蚴囊壁的增強(qiáng)作用

蔡 輝，趙海龍，葉 彬，劉愛波，陳露露，張 靜，王夢瑩

囊型包蟲病(cystic echinococcosis)是由細(xì)粒棘球絳蟲(echinococcosis)的幼蟲寄生所引起的人獸共患病，肝臟為最易受累器官。盡管囊型包蟲病的診斷和治療技術(shù)都有了很大的發(fā)展，但該病仍在世界上許多發(fā)展中國家流行[1]。目前，手術(shù)仍為包蟲病最主要的治療方式。術(shù)中原頭節(jié)的泄漏以及術(shù)后原頭節(jié)和生發(fā)層的殘留是引起包蟲病復(fù)發(fā)的最主要原因[2]。本項(xiàng)目組發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度聚焦超聲(high intensity focused ultrasound，HIFU)對離體棘球蚴有一定的殺傷效果[3]。且超聲造影劑(ultrasound contrast agent，UCA)可增強(qiáng)HIFU的空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，從而增強(qiáng)HIFU對棘球蚴內(nèi)原頭節(jié)的殺傷效果[4]。本試驗(yàn)擬探索UCA協(xié)同HIFU輻照離體細(xì)粒棘球蚴后囊壁的損傷情況，了解UCA協(xié)同HIFU殺傷棘球蚴的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器 JC型高強(qiáng)度聚焦超聲腫瘤治療系統(tǒng)由青海大學(xué)附屬醫(yī)院提供。

1.1.2主要試劑 超聲造影劑由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲影像學(xué)研究所提供(按照使用說明，將其用5 mL生理鹽水溶解，溶解后微泡濃度約為1×109個(gè)/mL，直徑3.5～4.5 μm，分布均勻)；20%多聚甲醛；2.5%戊二醛由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院電鏡室提供。

1.1.3棘球蚴標(biāo)本 感染棘球蚴的羊肝采自青海省西寧市某屠宰場。標(biāo)本取出后立即放入冰盒并送往實(shí)驗(yàn)室。用生理鹽水洗凈羊肝表面血跡，B超檢測病灶大小，選取形狀為球形或近似球形、直徑30 mm、囊壁較薄且彈性良好的棘球蚴作為實(shí)驗(yàn)材料。修整后置入生理鹽水中備用。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 選取15個(gè)直徑為30 mm左右的包囊隨機(jī)分為3組：對照組，接受超聲假照；單純HIFU組，接受100 W HIFU輻照；HIFU+UCA組，注入0.1 mL UCA后進(jìn)行HIFU輻照。

HIFU參數(shù)如下：治療掃描方式為點(diǎn)掃射，掃描速度3 mm/s，每個(gè)點(diǎn)掃描3次，每次3 s，層間距5 mm。治療功率為100 W。治療時(shí)間不等，由包囊大小決定。

1.2.2超聲圖像灰度變化 包囊的每個(gè)層面治療結(jié)束后，肉眼觀察監(jiān)控圖像所示灰度變化，并立即用系統(tǒng)自帶灰度分析軟件分析靶區(qū)治療前后的灰度變化。

1.2.3包囊處理后立即剪開包囊，肉眼觀察內(nèi)囊變化 每個(gè)囊壁隨機(jī)剪取不同部位的組織塊，置入分裝的2.5%戊二醛中固定留作投射電鏡和掃描電鏡標(biāo)本。同時(shí)，每個(gè)囊壁隨機(jī)取樣固定于20%多聚甲醛中，留作病理切片標(biāo)本。

2 結(jié) 果

2.1超聲監(jiān)控觀察 超聲實(shí)時(shí)監(jiān)控顯示，對照組棘球蚴邊緣回聲欠清晰，內(nèi)部存在一回聲均勻的液性暗區(qū)(圖1A)；HIFU輻照后，包囊邊緣回聲增強(qiáng)，內(nèi)部出現(xiàn)點(diǎn)狀回聲增強(qiáng)(圖1B)；UCA協(xié)同HIFU輻照后，包囊邊緣回聲增強(qiáng)，內(nèi)部出現(xiàn)團(tuán)狀回聲增強(qiáng)，且回聲增強(qiáng)程度比單純HIFU輻照更為顯著(圖1C)。

圖1棘球蚴的超聲實(shí)時(shí)監(jiān)控圖像

圖A：對照組包囊超聲圖像；圖B：單純HIFU組包囊超聲圖像；圖C：HIFU+UCA組包囊超聲圖像。

Fig.1UltrasoundimagesofhydatidcystsduringHIFUablation

A: Control, dark-shaded areas were observed and the edge of the cysts was irregular and unclear (cysts were shown by arrows);

B: Treated with HIFU alone, the borderline echo of hydatid cysts was clearer and the inner echo of cysts was enhanced in small range locally (cysts were shown by arrows);

C: Treated with 0.1 mL UCA+HIFU, the borderline echo of cysts was clearer and the inner echo of cysts was enhanced in small range locally. The ultrasound echo change of the cysts ablated with HIFU aided by UCA was more obvious than that of cysts ablated with 100 W HIFU alone (cysts were shown by arrows).

2.2肉眼觀察 對照組棘球蚴囊壁布滿“白砂狀”育囊(圖2A)；經(jīng)HIFU輻照后，育囊明顯減少，且很多殘留的育囊從生發(fā)層脫落，囊壁變軟(圖2B)；UCA協(xié)同HIFU輻照后，肉眼未見育囊，囊壁變軟，卷曲(圖2C)。

2.3囊壁病理觀察 正常棘球蚴囊壁的角質(zhì)層規(guī)則、平滑且不易著色，生發(fā)層清晰，核清晰可見(圖3A)；HIFU輻照后，生發(fā)層遭到嚴(yán)重破壞，僅有少量殘留，核消失，角質(zhì)層增粗，紊亂，扭曲，易著色(圖3B)；UCA協(xié)同HIFU輻照后，生發(fā)層幾乎無殘留，角質(zhì)層增粗，紊亂，扭曲，部分出現(xiàn)斷裂(圖3C)。

2.4掃描電鏡觀察 正常棘球蚴囊壁表面生發(fā)層布滿育囊，未見生發(fā)層(圖4A)；HIFU輻照后，生發(fā)層遭到破壞，可觀察到扭曲的角質(zhì)層(圖4B)；UCA協(xié)同HIFU輻照后，生發(fā)層僅殘留少數(shù)碎片，角質(zhì)層遭到嚴(yán)重破壞，表面數(shù)層出現(xiàn)缺損(圖4C)。

2.5透射電鏡觀察 正常的棘球蚴囊壁角質(zhì)層紋理規(guī)則，光滑，致密，生發(fā)層的細(xì)胞核和細(xì)胞器清晰，形態(tài)正常(圖5A)；HIFU輻照后，角質(zhì)層紋理增粗，紊亂，偶見生發(fā)層及變形的細(xì)胞器(圖5B)；UCA協(xié)同HIFU輻照后，角質(zhì)層紋理增粗，紊亂，出現(xiàn)斷裂。未見生發(fā)層及細(xì)胞器(圖5C)。

圖2棘球蚴囊壁的肉眼觀察

圖A：對照組包囊內(nèi)囊肉眼觀；圖B：單純HIFU組包囊內(nèi)囊肉眼觀；圖C：HIFU+UCA組包囊內(nèi)囊肉眼觀。

Fig.2GrossobservationofcystwallsafterHIFUablation

A: Control, germinal layer was covered with brood capsules;

B: Treated with HIFU alone, the number of brood capsule was decreased obviously, and some residual brood capsules sloughed from germinal layer;

C: Treated with 0.1 mL UCA+HIFU, brood capsule was not observed, cyst walls were softened and curly.

圖3囊壁的病理觀察(×100)

圖A：對照組包囊囊壁病理觀察；圖B：單純HIFU組包囊囊壁病理觀察；圖C：HIFU+UCA組包囊囊壁病理觀察。

Fig.3PathologicalchangesofcystwallsafterHIFUablation(×100)

A: Control, the laminated layer was clear and uniform (L), and its germinal layer with clear structure and visible nuclei (G);

B: Treated with HIFU alone, the laminated layer with rough veins and uneven spacing (L), and its germinal layer with unclear structure and nuclei disappeared (G);

C: Treated with 0.1 mL UCA+HIFU, the laminated layer, incrassation in veins, rough, and curved (L), and its germinal layer nearly disappeared (G).

圖4囊壁掃描電鏡觀察

圖A：對照組包囊囊壁掃描電鏡觀察；圖B：單純HIFU組包囊囊壁掃描電鏡觀察；

圖C：HIFU+UCA組包囊囊壁掃描電鏡觀察。

Fig.4StructuresofcystwallsafterHIFUablationunderscanningelectronmicroscope

A: Control, the germinal layer surface of the vesicle wall was densely covered by parasite tissue (L),×1 000;

B: Treated with HIFU alone, the germinal layer was destroyed (G) and the twisting laminated layer could be observed,×200;

C: Treated with 0.1 mL UCA+HIFU, a little fragment of germinal layer and laminated layer defect (L) could be observed,×250.

圖5囊壁透射電鏡觀察

圖A：對照組包囊囊壁透射電鏡觀察；圖B：單純HIFU組包囊囊壁透射電鏡觀察；圖C：HIFU+UCA組包囊囊壁透射電鏡觀察。

Fig.5StructuresofcystwallsafterHIFUablationundertransmissionelectronmicroscope

A: Control, the laminated layer was clear and uniform (L), the germinal layer with clear structure, and organelle structure were normal (G),×7 000;

B: Treated with HIFU alone, the laminated layer with rough veins and uneven spacing (L),×4 000;

C: Treated with 0.1 mL UCA+HIFU, the laminated layer, incrassation in veins, rough, and curved (L), and its germinal layer nearly disappeared,×5 000.

3 討 論

當(dāng)前，囊型包蟲病的治療方式主要有手術(shù)治療、藥物治療和介入治療3種方式[5]。由于囊壁的阻隔作用，藥物難以在棘球蚴內(nèi)部達(dá)到有效的作用濃度，從而影響治療效果。因此 ，藥物只是包蟲病的輔助治療手段，手術(shù)仍然是包蟲病最主要的治療方式。手術(shù)主要包括內(nèi)囊摘除術(shù)和囊腫完全切除術(shù)，雖然手術(shù)技術(shù)有了提高，但是手術(shù)創(chuàng)傷過大，且術(shù)后包蟲病復(fù)發(fā)率較高[6]。近年來，微創(chuàng)介入已經(jīng)應(yīng)用于包蟲病的治療。雖然仍不能完全避免殘留原頭節(jié)和生發(fā)層引起的包蟲病復(fù)發(fā)，但該方法具有創(chuàng)傷性小恢復(fù)快的優(yōu)點(diǎn)，因此，包蟲病的微創(chuàng)治療已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[7]。

本項(xiàng)目組發(fā)現(xiàn)，HIFU對離體原頭節(jié)和棘球蚴均有一定的殺傷作用[3,8]。HIFU是一種新興的治療技術(shù)，已經(jīng)用于腫瘤的治療。其原理主要是將聲波能量聚焦于靶點(diǎn)，通過熱效應(yīng)和空化效應(yīng)使治療靶點(diǎn)產(chǎn)生凝固性壞死而不損傷周圍的正常組織[9]。由于其具有非侵入性的優(yōu)點(diǎn)，將其引入包蟲病的治療可以避免原頭節(jié)的泄漏引起的繼發(fā)性感染。但是由于棘球蚴內(nèi)部充滿囊液，使超聲能量不能在囊內(nèi)聚焦，導(dǎo)致一定治療劑量的HIFU對棘球蚴的殺傷效果欠佳。提高HIFU功率或者延長治療時(shí)間可完全殺滅棘球蚴，但此舉會(huì)同時(shí)增加HIFU治療時(shí)并發(fā)癥(如正常組織灼傷和麻醉意外等)的發(fā)生率。

為提高HIFU的殺傷效應(yīng)，我們將UCA作為增效劑引入HIFU殺傷棘球蚴的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然單純加入U(xiǎn)CA對棘球蚴并無殺傷作用，但UCA可在不提高HIFU治療劑量的前提下，通過增強(qiáng)HIFU的空化效應(yīng)來提高HIFU對離體原頭節(jié)和棘球蚴的殺傷效果[4,10]。因包蟲病的復(fù)發(fā)主要是由于殘留的原頭節(jié)和囊壁所導(dǎo)致，為探索UCA作為HIFU增效劑進(jìn)行包蟲病治療的可行性，有必要對UCA協(xié)同HIFU輻照后囊壁的損傷情況進(jìn)行觀察。

為更好的觀察UCA對HIFU破壞棘球蚴囊壁的增效作用，根據(jù)前期結(jié)果，本文選取HIFU功率為100 W、UCA量為0.1 mL進(jìn)行試驗(yàn)[3-4]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一定功率的HIFU可對棘球蚴囊壁的生發(fā)層和角質(zhì)層造成一定程度的破壞，但是生發(fā)層仍有殘留，聯(lián)用UCA后，生發(fā)層基本無殘余,角質(zhì)層也遭到了更為嚴(yán)重的破壞。研究認(rèn)為，超聲監(jiān)控能顯示治療有效的特征性表現(xiàn)，通過觀察超聲的灰度值變化，可以間接的指導(dǎo)制定治療劑量和判斷治療效果[11]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聯(lián)用UCA后，超聲圖像灰度增強(qiáng)比單純HIFU輻照增強(qiáng)更為顯著，間接證明了UCA可增強(qiáng)HIFU對離體棘球蚴的殺傷作用。Yang認(rèn)為UCA主要通過增強(qiáng)HIFU的空化效應(yīng)來提高其治療效果[12]。分析聯(lián)用UCA后，HIFU輻照可使囊壁破壞加重的原因，認(rèn)為UCA的引入，增加了空化核的數(shù)量，HIFU輻照使微泡爆炸，產(chǎn)生更大的能量，使囊壁的蛋白和纖維發(fā)生不可逆的損傷，從而破壞囊壁。

UCA在臨床上主要用于超聲圖像顯影的增強(qiáng)，其安全性已被證實(shí)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，可將UCA以靜脈注射的方式注入動(dòng)物體內(nèi)，因此，將UCA作為增效劑引入HIFU治療包蟲病有以下優(yōu)點(diǎn)：HIFU治療是非侵入性治療，患者痛苦小，恢復(fù)快, 還可避免手術(shù)或介入治療時(shí)原頭節(jié)泄漏引起的包蟲病復(fù)發(fā)；UCA可使HIFU的超聲監(jiān)控圖像更為清晰，有利于治療靶點(diǎn)的定位；UCA聯(lián)合HIFU輻照所致的囊壁角質(zhì)層遭到破壞，可能有利于藥物穿過囊壁，提高囊內(nèi)的藥物濃度，從而提高藥物治療效果。因此，UCA可增強(qiáng)HIFU對離體棘球蚴內(nèi)原頭節(jié)的殺傷效果，并能提高HIFU對棘球蚴囊壁的破壞作用，為進(jìn)一步的動(dòng)物試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

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