基于復合納米材料和酶切信號放大電化學適體傳感器檢測沙門氏菌

徐連應,王畢妮,張富新

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基于復合納米材料和酶切信號放大電化學適體傳感器檢測沙門氏菌

徐連應,王畢妮,張富新

（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，西安 710119）

沙門氏菌是食品中致病菌檢測的一項重要指標。本研究擬構建一種實用性更強的用于沙門氏菌檢測的新型電化學適配體傳感器，以克服各種沙門氏菌傳統(tǒng)檢測方法的缺陷。通過混合還原氧化石墨烯（rGO）溶液與甲苯胺藍（Tb）溶液制得Tb-rGO復合物，再將此復合物分散于納米金（AuNPs）溶膠中得到AuNPs-Tb-rGO復合物。最后將AuNPs-Tb-rGO復合物與帶有氨基的DNA鏈（S1）孵育得DNA-復合納米材料（S1-AuNPs-Tb-rGO）。通過金硫鍵將沙門氏菌適配體互補鏈（S2）修飾在金電極表面，以己硫醇為封閉劑消除非特異性吸附后，滴涂沙門氏菌適配體（Apt）于電極表面，使Apt與S2雜交結合。將修飾好的電極浸入含有沙門氏菌與核酸外切酶I（I）的混合液中，基于I信號放大效應，利用適配體對沙門氏菌的特異性結合作用，循環(huán)帶離適配體，再通過S1-AuNPs-Tb-rGO中的S1與S2雜交將S1-AuNPs-Tb-rGO負載到電極表面，監(jiān)測電極表面的電化學信號，并對在菌液中的孵育時間、I濃度和S1-AuNPs-Tb-rGO濃度進行優(yōu)化，構建沙門氏菌電化學適配體傳感器。使用該傳感器，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單增李斯特菌和阪崎腸桿菌進行檢測，以確定沙門氏菌電化學適配體的特異性；對6×102—6×106cfu/mL的沙門氏菌進行檢測，以確定沙門氏菌電化學適配體傳感器的敏感性；對羊奶樣品進行檢測，以確定沙門氏菌電化學適配體傳感器的實用性。所建立的沙門氏菌電化學適配體傳感器在菌液中的最佳孵育時間為1 h，I的最適濃度為0.6 U?μL-1，S1-AuNPs-Tb-rGO的最適濃度為200 nmol?L-1。在進行沙門氏菌的檢測時，沙門氏菌與Apt特異結合，S1-AuNPs-Tb-rGO復合納米材料被結合到電極表面使其線性伏安曲線氧化峰升高。特異性試驗結果表明，所建立的方法僅對沙門氏菌的檢測有電信號響應，而對非目標菌無響應。敏感性試驗結果表明，所構建的沙門氏菌電化學適配體傳感器，具有很高的敏感性，對沙門氏菌檢測的敏感性達200 cfu/mL。使用建立的沙門氏菌電化學適配體傳感器對羊奶中的沙門氏菌含量進行測定，加標回收率在91.6%—106.3%，結果令人滿意。所建立的沙門氏菌電化學適配體傳感器具有操作簡便、檢測范圍寬、檢出限低和成本低廉等優(yōu)點，有望應用于食品工業(yè)中沙門氏菌的現(xiàn)場快速定量檢測。

沙門氏菌；電化學適配體傳感器；還原氧化石墨烯；甲苯胺藍；納米金；核酸外切酶I

0 引言

【研究意義】沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，其主要傳播方式為人攝入被污染的牛奶、肉類和雞蛋等動物性食品[1]。大量對沙門氏菌疫情的調(diào)查和對志愿者的研究顯示出一些特定的沙門氏菌菌株在極低的劑量下即可引發(fā)疾病[2]，因此，開展沙門氏菌相關檢測技術研究，對食源性疾病的預防和控制具有重要作用?！厩叭搜芯窟M展】目前，最常用的沙門氏菌檢測方法主要有3種：傳統(tǒng)的微生物平板計數(shù)法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）以及聚合酶鏈式反應。傳統(tǒng)的微生物平板計數(shù)法操作繁瑣、耗時過長且準確度低，不便用于沙門氏菌的檢測。ELISA和PCR可將檢測時間由傳統(tǒng)的幾天縮短至數(shù)小時[3]，但ELISA法依靠的是抗原抗體間的特異性結合，靶物質(zhì)為菌體表面的抗原或特征毒素，而PCR法是將目標DNA體外擴增來完成定性或定量檢測的，這兩種方法均無法直接測定菌體本體。因此，建立簡便、快速、高效和成本低廉的沙門氏菌檢測方法成為目前食品現(xiàn)場快速檢測的迫切需求。近年來，材料學、生物學、電化學等學科的迅速發(fā)展給電化學傳感技術的研究提供了極大的便利，新型電化學傳感器的研發(fā)與實際應用已經(jīng)成為當下熱點。在食品檢測領域，電化學生物傳感器憑借其檢測迅速、操作簡便、成本低廉、靈敏度高、特異性強、重復性好、無需對樣本進行特殊處理，能在復雜的電化學體系中進行實時監(jiān)測甚至活體分析等獨有的優(yōu)越性得到了廣泛的應用[4-6]。目前已有報道表明電化學免疫傳感器、電化學DNA傳感器和電化學適體傳感器等電化學生物傳感器可用于食源性致病菌的檢測。其中，相較于電化學免疫傳感器中抗體的不易合成、不穩(wěn)定性和不易修飾[7]以及電化學DNA傳感器中復雜的PCR技術，電化學適體傳感器在食源性致病菌檢測上顯示出了明顯的優(yōu)勢。電化學適體傳感器的適配體是一段DNA或RNA序列，其具有能與目標物特異并緊密的結合、易于合成、性質(zhì)穩(wěn)定、成本低廉、化學修飾簡便、檢測限低等優(yōu)點[8-9]。此外，適配體可以被許多熒光染料或標簽所修飾，這為檢驗檢測提供了極大的便利[10]。還原氧化石墨烯（rGO）是以石墨烯為原料，經(jīng)過一系列修飾及還原得到的新型納米材料。在生物傳感器的應用中，還原氧化石墨烯因其硬度大、機械強度高、導電能力和力學性能優(yōu)異、比表面積大，生物相容性、親水性和分散性良好，原料易得及價格便宜等特點而被廣泛用于提高電子傳輸[11-17]。甲苯胺藍（Tb）是一種應用廣泛的電化學活性物質(zhì)，能與rGO作用得到Tb-rGO復合物，從而使rGO的溶解度和自組裝性能得到提升，使Tb能夠更好地固定，并使電化學信號增強而易于檢測[18]。納米金是指直徑在1—100 nm金的微小顆粒。在電化學方面，金納米粒子的使用可以顯著增加電化學反應的反應表面積，提高電子的傳輸速率，從而使電化學信號得到明顯放大，以便于實際檢測[19]。核酸外切酶I（I）是一種從3′到5′方向按序催化水解磷酸二酯鍵，最終產(chǎn)物為單個核苷酸的酶。I不依賴特異性核酸序列，無需靶DNA存在特異性識別位點即可協(xié)助信號放大，在生物傳感器的應用中具有良好的通用性[20]。【本研究切入點】已有的關于應用電化學適配體傳感器進行沙門氏菌定量檢測的報道并不多見，但在已報道的數(shù)篇成功構建的沙門氏菌電化學適配體傳感器的研究中，檢測時間縮短、檢測范圍變寬和最低檢測限下降等優(yōu)勢十分明顯[21-23]。這表明電化學適配體傳感器在沙門氏菌的定量檢測上具有良好的應用前景，傳感器的各方面性能有望進一步優(yōu)化?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用DNA與AuNPs的相互作用制備DNA-復合納米材料S1-AuNPs-Tb-rGO；在金電極表面自組裝沙門氏菌適體鏈及其互補鏈。通過目標物沙門氏菌的特異性識別，將適體鏈從電極表面脫離，殘留在電極表面的互補鏈與S1-AuNPs-Tb-rGO互補配對，通過評價其電化學活性間接完成對沙門氏菌的檢測，建立一種用于沙門氏菌定量檢測的電化學生物傳感分析新方法。

1 材料與方法

試驗于2016年9—11月在陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院畜產(chǎn)品加工實驗室進行。

1.1 菌株和DNA序列

沙門氏菌適配體（Apt，5′-GAGTTAATCAATAGG GGGAACATCCTTGGCGGTGC-3′）、氨基化的DNA鏈（S1，5′-NH2-(CH)6-GAGTTAATCAATACAAGGC GGGAACATCCTTGGCGGTGC-3′）、沙門氏菌適配體互補鏈（S2，5′-HS-(CH)6-GCACCGCCAAGGATGT TCCCGCCTTGTATTGATTAACTC-3′），均來源于上海生工生物工程有限公司。鼠傷寒沙門氏菌CMCC 50115、大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、福氏志賀氏菌CMCC 51572、單核增生李斯特菌ATCC 19115、阪崎腸桿菌ATCC 51329均購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司。

1.2 儀器和試劑

所有電化學試驗操作均在CHI660C型電化學工作站上（上海辰華儀器有限公司）完成。試驗采用三電極系統(tǒng)：金電極為工作電極，鉑絲為對電極，銀/氯化銀（飽和氯化鉀）電極為參比電極。本研究還需要的主要儀器包括KQ-100V型超聲波清洗器（上海京工實業(yè)有限公司），DF-101系列集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（金壇市金祥龍電子有限公司），漩渦振蕩器（北京中西遠大科技有限公司），離心機（HERMLE），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），真空干燥箱（上海圣科儀器設備有限公司）。

試驗試劑核酸外切酶I（Exonuclease I，I）購自紐英倫生物技術（北京）有限公司；氯金酸（HAuCl4）、甲苯胺藍（Tb）、己硫醇（96%，HT）購自美國Sigma Aldrich公司；鐵氰化鉀（K3[Fe(CN)6]）、亞鐵氰化鉀（K4Fe(CN)6?3H2O）、Na2HPO4、NaH2P04、KCl、檸檬酸三鈉、濃硫酸、無水乙醇等購自天津科密歐化學試劑有限公司；石墨烯（Gra）購自南京吉倉納米科技有限公司；其他所用試劑均為分析純；試驗用水為蒸餾水。

1.3 溶液的配制

沙門氏菌適配體、DNA-復合納米材料和沙門氏菌適配體互補鏈均在12 000 r/min下離心30—60 s后加入適量無菌水充分震蕩均勻，置于-20℃冷藏。

核酸外切酶I反應緩沖液：將隨酶提供的10×核酸外切酶I反應緩沖液用無菌水稀釋成1×核酸外切酶I反應緩沖液。

各濃度菌液均以pH 7.0的0.1 mol?L-1PBS緩沖溶液配制，4℃保存。

甲苯胺藍以pH 7.0的0.1 mol?L-1PBS緩沖溶液配制成濃度為1 mmol?L-1的溶液，保存4℃。

己硫醇（HT）溶液以無水乙醇溶液配制成濃度為1 mmol?L-1的溶液，4℃保存。

1.4 樣品處理

根據(jù)LUO等[24]的方法在無菌羊奶中滴加不同濃度的菌液，放置1 h后，再滴加1 mL的PBST溶液，振蕩混合，采用離心的方式去除上清液中的脂質(zhì)和蛋白，最后用PBS緩沖液重懸細菌。

1.5 金納米粒子的制備

根據(jù) Turkevich-Frens法[25-26]，采用檸檬酸三鈉還原氯金酸完成金納米粒子的制備。金納米粒子的粒徑以改變還原劑使用量的方式控制。在攪拌狀態(tài)下將0.5 mL 1 mmol?L-1的HAuCl4與18.5 mL的水加熱，沸騰后迅速將其加入到0.5 mL 0.01 mol?L-1的檸檬酸三鈉溶液中。等待約數(shù)分鐘后，可觀察到溶液顏色變?yōu)榫萍t色，此時不再加熱，攪拌溶液并將其在室溫下自然冷卻。將還原生成的金納米粒子置于棕色試劑瓶內(nèi)保存于4℃。

1.6 氧化石墨烯的制備

采用傳統(tǒng)的Hummers方法[27-28]完成氧化石墨烯的制備。詳細步驟為：在冰浴條件下，依次將2.0 g的石墨片和1.6 g的硝酸鈉加入體積為67.5 mL的98%的H2SO4中；然后加入9.0 g KMnO4并磁力攪拌35 min；室溫下攪拌5 d后取560 mL超純水緩慢加入反應釜后，用30% H2O2溶液處理至懸浮液變?yōu)榱咙S色；最后離心處理懸浮液，清洗烘干，即得氧化石墨烯。

1.7 DNA-復合納米材料的制備

在10 mL穩(wěn)定分散的氧化石墨烯（1 mg?mL-1）中加入80 μL質(zhì)量分數(shù)為80%的水合肼，加熱至90℃后不斷攪拌12 h，制得的黑色還原氧化石墨烯經(jīng)雙蒸水多次洗滌后離心收集。將5 mL 1 mg?mL-1的還原氧化石墨烯與5 mL 1 mg?mL-1的甲苯胺藍溶液在室溫下攪拌24 h混合均勻，在π-π鍵的作用下[29]，甲苯胺藍與還原氧化石墨烯相結合而得到Tb-rGO雜化復合納米材料。取5 mg Tb-rGO復合納米材料經(jīng)多次離心水洗分散到10 mL金納米溶膠（AuNPs）中后攪拌30 min。將按上述方法制備的AuNPs-Tb-rGO復合納米材料再次離心后重懸在10 mL雙蒸水中，之后與200 μL 2 μmol?L-1帶有氨基的DNA鏈（S1）在4℃下孵育12 h。在氨基與納米金溶膠的強作用下[30]，S1被標記到AuNPs-Tb-rGO上得到DNA-復合納米材料S1-AuNPs-Tb-rGO。離心除去未結合的DNA，再將得到的DNA-復合納米材料重新分散在10 mL的雙蒸水中置于4℃下保存?zhèn)溆肹18]。

1.8 基于酶切信號放大的電化學適體傳感器的構建

整個構建過程如圖1所示。將裸金電極在加入了0.05 μm三氧化二鋁粉末的鹿皮上反復打磨至金電極表面光滑。然后將電極用去離子水沖洗后超聲處理5分鐘。將濃硫酸滴加到金電極表面保持10 min，然后用去離子水沖洗掉殘留在金電極表面的污染物。在金電極上滴涂濃度為2 μmol?L-1的沙門氏菌適配體互補鏈（S2）10 μL，室溫下孵育一段時間后用PBS緩沖液沖洗，再將10 μL 1 mmol?L-1的己硫醇（HT）溶液滴涂于電極表面反應1 h以起到封閉電極的作用[18]。然后將濃度為2 μmol?L-1的沙門氏菌適體鏈（Apt）10 μL滴涂于電極表面，一段時間后用PBS緩沖液沖洗。隨后將電極浸入含不同濃度沙門氏菌和一定濃度核酸外切酶I（I）中37℃下反應30 min后，用PBS緩沖液沖洗。最后與10 μL S1-AuNPs-Tb-rGO雜交反應2 h。采用循環(huán)伏安法（CV）和電化學阻抗法（EIS）記錄S1-AuNPs-Tb-rGO中Tb的電化學信號，實現(xiàn)對沙門氏菌的檢測。

圖1 電化學適配體傳感器檢測沙門氏菌原理圖

1.9 電化學測試方法

循環(huán)伏安（CV）、差分脈沖伏安（DPV）和電化學阻抗（EIS）檢測采用三電極系統(tǒng)，被互補鏈修飾的金電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極。CV和EIS的檢測環(huán)境為5 mmol?L-1K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液，由200 mmol?L-1PBS （含100 mmol?L-1KCl，pH 7.0）配制。DPV的檢測環(huán)境為10 mmol?L-1PBS緩沖溶液（含20 mmol?L-1KCl, pH 7.0）。CV掃描范圍為-0.2—0.6 V，掃描速率為100 mV?s-1。DPV初始電位為0 V，終止電位為0.4 V，電位增量為0.004 V，振幅為0.05 V，脈沖寬度為0.05 s，采樣寬度為0.016 s。EIS振幅為0.005 V，頻率范圍為1—100 000 Hz。

2 結果

2.1 修飾電極的電化學表征

采用電化學阻抗法（EIS）和循環(huán)伏安法（CV）檢測本研究所構建的傳感器，以完成對各步驟電極修飾情況的驗證。對于EIS，[Fe(CN)6]4-/3-耦合作為氧化還原探針，電荷轉(zhuǎn)移所受到的阻力（Ret）由阻抗圖譜來判斷。如圖2-A所示，裸金電極（a）呈現(xiàn)的半圓很小，這是因為電子可以在裸金電極上自由移動。當沙門氏菌適配體互補鏈自組裝到金電極上后，由于單鏈DNA上的負電荷磷酸鹽骨架對電子在電極和Fe(CN)63-/4-溶液中的轉(zhuǎn)移形成阻礙，而導致Ret（b）增大。當?shù)渭拥纳抽T氏菌適配體與其互補鏈雜交形成雙鏈DNA結構后，金電極上負電荷的增加導致Ret（c）進一步增加。當沙門氏菌被檢測到后，由于沙門氏菌與適配體結合將適配體帶離金電極表面，會導致電極上負電荷減少，對電子移動的空間阻力減小，同時，I將適配體不斷剪切從而釋放沙門氏菌循環(huán)利用，使得未滴加I的電極Ret（d）減小程度較滴加I的電極Ret（e）小。加入S1-AuNPs-Tb-Gra后，由于Tb是一種電化學活性物質(zhì)，可以促進電子的傳遞，故半圓直徑明顯減?。╢）。同時用CV法進行驗證，結果如圖2-B所示。由圖可知CV法與EIS法所得出的結果相吻合。通過這兩種方法可以證明本試驗每一步得到了準確的修飾。

a：裸金電極，b：互補鏈修飾后的電極，c：適體鏈與互補鏈雜交后的電極，d：電化學傳感器檢測到鼠傷寒沙門氏菌后（未滴加Exo I），e：電化學傳感器檢測到沙門氏菌后（滴加Exo I），f：最后雜交標記有Tb的ssDNA的電極

2.2 條件優(yōu)化

2.3 電化學傳感器檢測分析性能的考察

在最優(yōu)的試驗條件下考察本試驗所構建的電化學適配體傳感器對沙門氏菌的檢測性能。圖4-A為將傳感器電極在不同濃度的沙門氏菌菌液中孵育1 h后所得到的差分脈沖伏安（DPV）曲線圖，包括空白對照組及不同稀釋梯度的沙門氏菌菌液的檢測結果。當菌液濃度增大，峰電流也隨之逐漸增大，并且在菌液濃度為6×102—6×106cfu/mL時，傳感器差分脈沖伏安曲線（DPV）的峰電流差值與菌液濃度的對數(shù)保持良好的線性關系，線性方程為（μA）=-2.5085-2.8573（2=0.9991），檢測限為200 cfu/mL（S/N=3）（圖4-B）。該方法能在1 h內(nèi)實現(xiàn)對沙門氏菌的檢測，與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法相比，該方法更加簡便、經(jīng)濟、高效（表1）。

圖3 試驗條件的優(yōu)化：（A）孵育時間（B）Exo I濃度（C）S1-AuNPs-Tb-Gra濃度

圖4 不同濃度的沙門氏菌（0—6×107 cfu/mL）對應的DPV曲線（A）及DPV峰電流差值與沙門氏菌濃度的校正曲線（B）

表1 本研究與其他文獻報道的沙門氏菌傳感器性能的比較

為了驗證該傳感器的特異性，在相同的條件下對另外5種細菌進行了檢測，5種細菌分別為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單增李斯特菌和阪崎腸桿菌。結果如圖5所示，其他5種非沙門氏菌細菌的電化學響應信號接近于空白信號，且明顯低于沙門氏菌的電化學響應信號，由此可以得出本試驗所構建的電化學傳感器在對于沙門氏菌的檢測上特異性良好。

a：沙門氏菌，b：大腸桿菌，c：金黃色葡萄球菌，d：志賀氏菌，e：單增李斯特菌，f：阪崎腸桿菌，g：空白對照

為了確保該傳感器的重復性，本研究進行了一組平行試驗：以相同的方法制備同批次的7根工作電極，在最優(yōu)條件下，將工作電極在稀釋倍數(shù)為10-6的沙門氏菌菌液中孵育30 min，并分別測量各峰電流值的變化，計算出RSD為4.2%（n=7），證明本研究所構置的電化學適配體傳感器具有良好的重復性。

2.4 實際樣本測定和加標回收試驗

利用本研究構建的電化學適配體傳感器對按1.4的方法預處理的含不同濃度沙門氏菌的羊奶樣品進行檢測，并與平板計數(shù)法作對比，計算回收率。由表2可知本方法與平板計數(shù)法檢測結果相吻合，回收率為91.6%—106.3%。這表明本研究構建的電化學適配體傳感器檢測沙門氏菌準確性高，可以用于實際樣本的檢測。

3 討論

本研究所構建的電化學適配體傳感器具有良好的靈敏性、特異性和穩(wěn)定性，其成功構建的關鍵因素主要有以下3個方面：

首先，石墨烯的比表面積大，導電性能優(yōu)異，熱穩(wěn)定性極佳，是當下最熱門的納米材料之一[11-17]。將石墨烯通過強氧化劑處理，在其表面修飾羥基、羧基、環(huán)氧基團等含氧官能團可以大幅度提高其親水性和分散性從而得到氧化石墨烯[39]。但氧化石墨烯導電能力差，限制了其在生物傳感器中的應用，為了克服這一缺點，氧化石墨烯通常要通過強還原劑或電化學還原法還原為還原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，rGO），使其在具有氧化石墨烯良好性能的同時擁有優(yōu)異的導電性[40]?，F(xiàn)已有報道表明還原氧化石墨烯可以通過π-π堆積、氫鍵、靜電力等方式有效吸附多種有機染料[41-42]，本研究將電化學活性有機染料甲苯胺藍與rGO結合形成Tb-Gra復合物，在提高rGO溶解性的同時也使Tb的固載量大幅度增加，實現(xiàn)了電化學信號的放大。

表2 羊奶樣品中沙門氏菌的檢測回收率

其次，由于核酸外切酶I的剪切特點是從3′到5′方向按序催化水解磷酸二酯鍵，最終產(chǎn)物為單個核苷酸，僅作用于單鏈DNA，且不依賴特定的DNA序列，故本研究引入此酶進行電化學信號的放大。當傳感器檢測到沙門氏菌后，由于沙門氏菌與其適配體的高強度特異性結合，適配體被帶離電極表面，此時核酸外切酶I迅速作用于適配體鏈，將其剪切為單個核苷酸。當適配體被剪切后，沙門氏菌被釋放出來繼續(xù)作用于電極上的適配體，將更多的適配體鏈帶離，以此實現(xiàn)沙門氏菌的循環(huán)作用。

另外，由SELEX技術篩選出的適配體通常為15—40個堿基對長的DNA或RNA序列，其化學性質(zhì)穩(wěn)定，靶分子不僅包括小分子，也包括細胞核大分子生物分子，氨基酸、各種種類的蛋白質(zhì)（酶、膜蛋白、病毒蛋白、細胞因子、生長因子和免疫球蛋白）、藥物、金屬離子、甚至整個細胞都可與適配體特異性結合[43]。本研究利用沙門氏菌適配體與沙門氏菌菌體的高強度結合，使適配體鏈與互補鏈分離，標記有電化學活性物質(zhì)Tb的S1-AuNPs-Tb-rGO鏈與固定在電極表面的互補鏈雜交，實現(xiàn)電化學信號的放大。同時由于適配體與菌體的特異性結合，保證了傳感器的高度特異性。

在工程項目建設中，業(yè)主和承包商之間要進行信息的交流和溝通，來達到自身利益最大化的目的。但在具體信息交流中，存在一些業(yè)主和承包商都不想透露給對方但雙方又都想從對方那里獲取到的隱性的信息。想要獲得這些隱性信息就要消耗大量的時間、金錢、物力等等。不管最終隱性信息獲取與否，都會給工程項目的建設增加一部分成本[2]。而信息的不對稱也會導致因盲目投資工程項目而提高投資者相應的投資風險。

4 結論

本研究成功構建了一種基于復合納米材料及酶切循環(huán)雙重信號放大的沙門氏菌電化學適配體傳感器。該傳感器對沙門氏菌的電化學檢測具有線性范圍寬，檢出限低，靈敏度高，特異性好的特點，所構建的傳感器也成功用于實際樣品羊奶中沙門氏菌的檢測。因此，本研究所構建的沙門氏菌電化學適配體傳感器有望應用于食品工業(yè)中沙門氏菌的定量檢測，同時也可以為其他食源性致病菌的檢測提供一種新型的檢測平臺。

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（責任編輯 趙伶俐）

An Electrochemical Aptasensor for Detection ofBased on Composite Nanomaterial and Enzymatic Recycling for Amplification

XU LianYing, WANG BiNi, ZHANG FuXin

(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119)

is an important detection target of pathogeny bacteria in food. In order to overcome the shortcomings of traditionaldetection methods, a novel assay of electrochemical aptasensor for quantitative detection ofwith better practicability was established.Reduced Graphene Oxide (rGO) solution and toluidine blue (Tb) solution were mixed together to obtain the Tb-rGO nanocomposite, and then the Tb-rGO nanocomposite was dispersed in gold nanoparticles (AuNPs) colloidal solution to obtain the AuNPs-Tb-rGO nanocomposite. Then, the as-prepared AuNPs-Tb-rGO nanocomposite was incubated with amino-DNA to obtain the DNA-nanocomposite (S1-AuNPs-Tb-rGO). The complementary strands of the aptamers of(S2) were attached to the surface of gold electrode by Au-S-bond, and then the electrode surface was blocked with HT. Subsequently, the aptamers of(Apt) were dripped onto the modified electrode to make Aptbind with S2. The modified electrode was immersed into the mixture containingand exonuclease I (I). In terms of the characteristics ofI that could amplify electrical signals and the aptamers that could exclusively bind with, the aptamers were taken away from S2circularly. Then, the S1-AuNPs-Tb-rGO composite was attached to the surface of electrode by the hybridization of S1and S2. Finally, the conditions of the incubation time in bacteria liquid, theI concentration and the S1-AuNPs-Tb-rGo composite concentration were optimized and the electrical signals of the electrode surface was monitored to construct the aptasensor. This electrochemical aptasensor was used to test,,,andto ensure the electrochemical aptasensor’s specificity. The electrochemical aptasensor was used to detect 6×102-6×106cfu/mLto ensure the electrochemical aptasensor’s sensitivity. Then this electrochemical aptasensor was used to detect the goat milk to evaluate the practical use of electrochemical aptasensor.The optimization of the electrochemical aptasensor incubation time in bacterial liquid, theI concentration and the S1-AuNPs-Tb-rGo composite concentration were studied in detail, and the optimal conditions were 1 h, 0.6 U?μL-1and 200 nmol?L-1. Whenwere tested existent, they had specific binding with Apt and the S1-AuNPs-Tb-rGo composite was attached to the electrode surface. So the linear sweep voltammetry curve of the electrochemical aptasensor showed a rise of oxidation peak. The developed aptasensor was specific toand did not react with non-target bacteria. The electrochemical aptasensor detected thetarget at a titer higher than 200 cfu/mL. A good recovery ofin the range of 91.6%-106.3% was obtained in goat milk by electrochemical aptasensor assays developed.This electrochemical aptasensor can detectwith a easy operation, a wide linear range, a high sensitivity and a low cost, which provide good application prospects in the field of rapid quantitative detection of salmonella.

; electrochemical aptasensor; reduced Graphene Oxide; toluidine blue; gold nanoparticles; Exonuclease I

2017-05-17；接受日期：2017-07-25

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃重大成果轉(zhuǎn)化引導專項（2016KTCG01-12）、中央高校基本科研業(yè)務費專項資金（GK201703063）

徐連應，E-mail：757443051@qq.com。通信作者張富新，E-mail：fuxinzh@snnu.edu.cn。通信作者王畢妮，E-mail：biniwang@snnu.edu.cn