分子生物學(xué)技術(shù)在臨床獸醫(yī)學(xué)上的研究與應(yīng)用

肖延光 郝占忠 魏雅茹 王素紅 趙愛民 （山東省聊城市畜牧站 252000）

近年來,生物技術(shù)不斷向深度和廣度迅猛發(fā)展，其發(fā)展與動物疫病的診斷、預(yù)防和治療技術(shù)之間已并無明顯的界限，并且起了不可替代的作用;如轉(zhuǎn)基因動物既能用于抗病育種，也能用于生產(chǎn)疫苗和藥品;核酸疫苗具有預(yù)防和治療的雙重作用;單克隆抗體不但用于免疫診斷，也可用于被動免疫和導(dǎo)向藥物治療等。生物技術(shù)已經(jīng)不是一項單一的技術(shù)，而是一個綜合的技術(shù)體系，尤其是在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用、發(fā)展中，需要多種不同技術(shù)、學(xué)科和領(lǐng)域的相互滲透、相互配合。

1 核酸的分子雜交

基因探針技術(shù)是臨床應(yīng)用最早的分子生物學(xué)技術(shù)，至今仍常盛不衰，它不僅用于微生物等基因鑒定方面，而且在印跡技術(shù)如(southern blot)方面以及新近成為熱門的基因芯片技術(shù)方面都有廣泛應(yīng)用，不少探針已商品化。

2 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)是一種體外模仿體內(nèi)DNA復(fù)制(擴(kuò)增)過程的技術(shù)?？梢栽诙虝r間內(nèi)大量復(fù)制出原來很少的DNA。其作為一種新的疾病檢測手段，具有靈敏、特異、簡便、快速等優(yōu)點，可以從一根毛發(fā)、一滴血、一個細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析診斷;PCR技術(shù)已逐漸應(yīng)用于遺傳性疾病、腫瘤及感染性疾病等的診斷。但該技術(shù)大多為定性分析，結(jié)果重復(fù)性差、可靠性低。因而，給臨床診斷帶來混亂。近年來常規(guī)PCR技術(shù)用于診斷、鑒定、科研、制備探針和進(jìn)一步結(jié)合基因工程進(jìn)行產(chǎn)品開發(fā)等，是一項極其有效、非常實用的技術(shù)，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展已衍生出許多新方法新技術(shù)，如:定量PCR技術(shù)、熒光PCR技術(shù)、巢式PCR、不對等PCR等。（1）定量PCR技術(shù):定量PCR技術(shù)巧妙利用了PCR技術(shù)的DNA高級擴(kuò)增、探針技術(shù)特異性和光譜技術(shù)的敏感性及定量分析的優(yōu)點?？朔顺Ｒ?guī)PCR定性檢測的一些不足，極大地提高了檢測的敏感性和特異性。（2）熒光PCR技術(shù):對比常規(guī)PCR技術(shù)，其是一種良好的檢測HBV-DNA的方法。試驗特異性強、重復(fù)性好(批內(nèi)、批間變異系數(shù)均<5%)，檢出陽性率和敏感性高。試驗條件標(biāo)準(zhǔn)化后，將有良好的臨床應(yīng)用價值。

3 DNA(基因)酶切圖譜分析

（1）DNA(基因)酶切圖譜分析即用特定的限制性酶消化(水解切斷)DNA長鏈后，可以得到核酸的片段。由于不同的DNA堿基序列不同，用識別某一特定堿基序列的限制酶進(jìn)行酶切時，所得到的DNA鏈片段的長短也不一樣(Makimura等，2002)。片段的長短可用凝膠電泳進(jìn)行分離后，與一系列已知分子量(或堿基對，bp)的標(biāo)準(zhǔn)參照物(或稱標(biāo)志物，marker)進(jìn)行比較，大體計算出各片段的分子量或堿基數(shù)。這一方法已廣泛應(yīng)用于臨床基因診斷。例如，當(dāng)一個基因發(fā)生點突變后引起某一限制酶識別點改變，就可以用本法檢測出來。（2）臨床和科研中已沿用多年的DNA限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP )，就是本法具體應(yīng)用的典型例子(Yu等，2002)。在畜群中，各個體基因的核苷酸序列會存在一定差異，稱為基因多態(tài)性?；蚨鄳B(tài)性位點普遍存在于動物的基因組中，某一致病基因與特定的多態(tài)性片段緊密連鎖，就可以用這一多態(tài)性片段作為一種“遺傳標(biāo)記”來判斷畜群或幼畜是否攜帶有致病基因。目前認(rèn)為基因多態(tài)性是個體的“身份證”;有的雖然不表現(xiàn)疾病，但也許會影響對藥物的反應(yīng)和用藥效果，因而有人提出將來會出現(xiàn)按個體基因型選擇用藥的種類和劑量的所謂“個體化”用藥。

4 單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析

單鏈構(gòu)象多態(tài)性是一種簡單、有效、快捷、廉價的檢測非常少量的基因組DNA或cDNA突變的技術(shù)。其原理及技術(shù)要點是:由于單一堿基的替代(改變)，引起DNA鏈構(gòu)象改變(Calegari等，2002)。后者可導(dǎo)致DNA在非變性凝膠電泳中出現(xiàn)遷移率的改變。因此，首先用PCR技術(shù)擴(kuò)增所檢驗的模板，然后進(jìn)行變性、電泳、顯示，根據(jù)顯示的條帶與標(biāo)準(zhǔn)參照物對比，即可判斷所測DNA鏈?zhǔn)欠裼凶儺悺?/p>

5 DNA序列測定

上述方法僅能大致了解某一核苷酸鏈片段是否存在變異，并不能確定哪一位點核苷酸發(fā)生變異和何種核苷酸取代了何種核苷酸，這就要求進(jìn)行基因測序。關(guān)于DNA測序的方法，因其十分復(fù)雜，一般臨床實驗室無法進(jìn)行。有必要時可委托有條件的公司或研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行，本文從略。由近幾年世界范圍進(jìn)行的人類基因組計劃(其主要步驟是基因測序)可知，當(dāng)今基因測序是一項大規(guī)模工程，可以自動化進(jìn)行。

6 DNA微陣列(DNA microarray)技術(shù)

DNA微陣列技術(shù)又稱蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)、生物芯片(biochip)技術(shù)，其是當(dāng)前分子生物學(xué)領(lǐng)域最熱門的技術(shù)，國內(nèi)外在競相開發(fā)，微陣列技術(shù)的大致步驟是:在一小片固相基質(zhì)(如修飾過的玻璃或尼龍膜片)上，高密度地點上成千上萬個DNA片段，制成微陣列，即DNA或生物芯片。檢測時采用分子雜交手段，將熒光標(biāo)記的標(biāo)本與微陣列進(jìn)行雜交，雜交完成并洗滌后，用激光共聚焦顯微掃描儀檢測熒光信號，通過微機(jī)處理分析，即可獲得檢測結(jié)果(Ja-cobs等，2003)。目前國內(nèi)外已制出多種生物芯片商品，其實際應(yīng)用亦已逐步展開。據(jù)文獻(xiàn)報道，微陣列技術(shù)應(yīng)用范圍極廣如致病微生物的檢出、癌基因及抑癌基因、組織配型、基因表達(dá)的研究、基因功能分析、基因制圖、基因突變和多態(tài)性的檢測等，是一項非常有發(fā)展前景，適合臨床檢驗應(yīng)用的先進(jìn)技術(shù)。

7 熒光原位雜交染色體分析(FISH)

熒光原位雜交染色體分析是一種在染色體上進(jìn)行基因定位的技術(shù)，其基本原理和步驟是:在已知某靶基因核苷酸序列的前提下，先合成與靶基因互補的經(jīng)熒光標(biāo)記的DNA探針，與常規(guī)方法制備的中期染色體進(jìn)行原位雜交。在熒光顯微鏡下可以觀察到該靶基因所在的染色體(臂、區(qū)、帶、亞帶)(Home等，2002)。其是一項非常有用的技術(shù)，它不僅可用于基因在染色體上定位的研究，而且可直接用于實驗室診斷。例如，慢性髓系白血病患者的9號與22號染色體的長臂相互易位所形成的Ph染色體，形成了一個融合基因—bcrabl(并編碼表達(dá)一種叫P120BCR/ABL的蛋白質(zhì))，這是該病發(fā)病的重要因素。早先用染色體分析鑒定這種染色體變異，準(zhǔn)確性差，陽性率也不高(Blasberg，2002)。改用bcrabl基因探針進(jìn)行原位雜交很容易鑒定，并且不一定需要分裂中期的染色體，在核內(nèi)處于間期的染色體也可檢出。目前在各類白血病中，已鑒定出好幾種類似的融合基因(Chatziioannou，2002)。為此，當(dāng)前對白血病的實驗室診斷，已由過去的M(形態(tài)學(xué))I(免疫學(xué)，即細(xì)胞表面分化抗原CD )C(細(xì)胞化學(xué)染色)改為MICM，后一M即指分子生物學(xué)。FISH在基因定位研究和診斷中的應(yīng)用還很多。

8 單抗阻斷ELISA檢測副雞嗜血桿菌血清型特異性抗體

苗得園等在副雞嗜血桿菌A，C型特異性單克隆抗體的基礎(chǔ)上成功建立了能區(qū)分A，C血清型抗體的阻斷ELISA診斷方法(Maclean等，2003)。并應(yīng)用此法對9種常見病原體陽性血清及多份免疫雞、人工感染雞、臨床可疑病雞血清和陰性血清進(jìn)行了檢測，結(jié)果證明，本法具有較好的特異性和敏感性，而且操作簡便、快速，是一種適用于雞傳染性鼻炎的診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢疫和監(jiān)測的良好方法。

一般來說，常規(guī)診斷技術(shù)具有應(yīng)用簡便、快速、易于掌握、費用低等優(yōu)點，是經(jīng)歷了漫長的歷史發(fā)展過程得以鞏固和完善的，因此，具有比較強的生命力。而生物高科技診斷技術(shù)卻不具備這樣的優(yōu)勢，不論是單克隆抗體還是核酸探針PCR等，其試劑的制備方法都比較復(fù)雜，需要昂貴的儀器設(shè)備和診斷試劑，對操作者的技術(shù)要求也較高，甚至對檢測結(jié)果的綜合評價也不很容易掌握(Her-schman，2003)。但是，現(xiàn)代生物技術(shù)作為一種高新技術(shù)，有著常規(guī)診斷方法不能比擬的優(yōu)越性，分子生物學(xué)檢測技術(shù)具有極高的敏感性與特異性，能夠區(qū)別細(xì)菌和病毒的疫苗株和野毒株，甚至可區(qū)別病毒間單個核苷酸的差別，可以監(jiān)測病原體的變異和漂移，預(yù)報疫病的大流行(杜立新，2003)，核酸探針和PCR技術(shù)還可檢測出整合到宿主體內(nèi)的病原體，對于進(jìn)行毒株鑒定、檢測隱性感染和免疫損害性疾病都具有重要意義。

因此，雖然在短時間內(nèi)這些診斷新技術(shù)難以真正達(dá)到推廣應(yīng)用，但對于重大疫情的及時預(yù)報和準(zhǔn)確定性都是不可或缺的。

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