結核分枝桿菌L型的誘導及其對抗菌藥物的敏感性

張學麗，肖紅俠，吳 琦

(天津市海河醫(yī)院，天津300350)

結核病嚴重影響人類健康，抗結核藥物的出現(xiàn)使結核病得到有效控制，但近10年，結核病疫情迅速回升，尤其耐藥結核病的流行，為結核病疫情的控制帶來更大的挑戰(zhàn)。有研究［1，2］表明，結核分枝桿菌菌壁缺失變異形成L型后可長期潛伏于宿主體內導致結核病復燃。同時有研究［3］表明，結核分枝桿菌L型是導致結核菌耐藥的原因之一。本研究觀察了結核分支桿菌L型的誘導及其對抗菌藥物的敏感性?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 結核分枝桿菌菌株 由標準結核分枝桿菌H37Rv菌株以比濁法稀釋成1億個菌細胞/mL的菌液備用。

1.2 培養(yǎng)基 由美國BD公司提供的960培養(yǎng)基作為結核分枝桿菌誘導培養(yǎng)基，按照文獻［4］配制培養(yǎng)基作為培養(yǎng)L型菌的非高滲培養(yǎng)基。用蒸餾水分別稀釋抗結核藥物利福平、異煙肼、乙胺丁醇的藥物原粉(Sigma公司)并加入BD960培養(yǎng)基，使其在每毫升培養(yǎng)基內的終濃度分別為:0.05、0.1、0.2 μg利福平，0.01、0.04、0.08 μg 異煙肼，1、2.5、5 μg 乙胺丁醇。并用蒸餾水稀釋抗菌藥物原粉分別加入羅氏培養(yǎng)基及非高滲培養(yǎng)基內，使藥物最終的質量濃度分別為:4 μg/mL 鏈霉素、0.2 μg/mL 異煙肼、40 μg/mL 利福平、2 μg/mL 乙胺丁醇、30 μg/mL 卡那霉素、1 μg/mL 對氨基水楊酸、40 μg/mL 卷曲霉素、3 μg/mL 氧氟沙星。

1.3 L型菌判定標準 結核分支桿菌L型菌株為煎蛋樣菌落，在高倍鏡下為圓球、卵圓或不規(guī)則形態(tài)，半透明或不透明，單個或鏈狀排列，沉于瓶底，不運動，不粘附瓶壁。抗酸染色見結核分支桿菌L型細胞為抗酸染色陰性，革蘭染色可見體積較小的L型細胞呈革蘭陰性，體積較大的L型細胞則為革蘭陽性。

1.4 結核分枝桿菌L型的誘導與分離 將結核分枝桿菌接種于含不同濃度的異煙肼、利福平、乙胺丁醇的BD960液體培養(yǎng)基，置溫箱37℃培養(yǎng)10 d后行抗酸染色，顯微鏡高倍鏡下觀察L型形成情況。之后用0.22 μm孔徑濾菌器過濾培養(yǎng)物，將濾過物接種于不含任何藥物的非高滲培養(yǎng)基內37℃培養(yǎng)并逐日觀察L型生長情況。L型密集生長(14～20/d)后，取培養(yǎng)物傳3代培養(yǎng)后作革蘭染色、抗酸染色后鏡檢。同時將結核分枝桿菌接種于不含藥物的BD960液體培養(yǎng)基內，置溫箱37℃培養(yǎng)10 d后行抗酸染色，顯微鏡高倍鏡下觀察細菌型及L型形成情況。取培養(yǎng)物接種改良羅氏培養(yǎng)基置溫箱內37℃分離培養(yǎng)。

1.5 結核分枝桿菌L型對抗菌藥物的敏感性檢測將結核分枝桿菌細菌型菌液及其L型的傳代純培養(yǎng)物分別接種于含不同抗菌藥物的羅氏培養(yǎng)基及非高滲培養(yǎng)基內，肉眼及顯微鏡觀察結核分枝桿菌及其L型的生長情況，并用比例法判斷結核分枝桿菌細菌型及L型的藥物敏感性。

2 結果

2.1 結核分枝桿菌L型的誘導形成 培養(yǎng)10 d后，顯微鏡高倍鏡下觀察，0.05 μg 利福平、0.01 μg異煙肼、1 μg乙胺丁醇培養(yǎng)基內均未見L型菌形成，但可見大量細菌型生長;而其他濃度藥物培養(yǎng)基內均可見L型菌形成，同時均可見有細菌型生長，其中 0.2 μg/mL 利福平、0.08 μg/mL 異煙肼、5 μg/mL乙胺丁醇的藥物培養(yǎng)基內的L型菌數(shù)量最多。0.1、0.2 μg/mL 利福平，0.04、0.08 μg/mL 異煙肼，2.5、5 μg/mL乙胺丁醇培養(yǎng)基的濾過液有典型油煎蛋樣菌落，顯微鏡下可見為L型菌生長，未見細菌型生長。高倍鏡下可見L型結核分枝桿菌為圓形、短桿形、不規(guī)則形，革蘭氏染色陰性;短桿形革蘭氏染色為陽性，抗酸染色為淡染。

結核分支桿菌在不含抗結核藥物的BD960液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后肉眼可見培養(yǎng)基微混濁，10 d后顯微鏡高倍鏡下可見細菌型大量生長，未見L型細胞。涂片抗酸染色可見典型形態(tài)的抗酸桿菌，接種改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10 d后可見結核分支桿菌菌落生長。

2.2 結核分枝桿菌L型對抗菌藥物的敏感性 結核分枝桿菌細菌型在含有上述不同抗菌藥物的羅氏培養(yǎng)基內培養(yǎng)14 d后均未見細菌型生長，但含有鏈霉素的培養(yǎng)基內可見L型形成，培養(yǎng)30 d后均未見細菌型及L型生長。結核分枝桿菌L型在含有鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、對氨基水楊酸的非高滲培養(yǎng)基內培養(yǎng)7 d后均可見其生長，而含有卡那霉素、卷曲霉素、氧氟沙星的培養(yǎng)基內未見生長。

3 討論

異煙肼、利福平、乙胺丁醇作為一線抗結核藥物被廣泛應用于抗結核治療，對結核病控制起到積極作用，它們主要是通過干擾結核分支桿菌的核酸、脂肪或蛋白質代謝而對繁殖期的結核分支桿菌產生抑制作用［5］。結核分枝桿菌L型是細胞壁缺陷的結核分枝桿菌，通常認為細菌在干擾細胞壁肽聚糖合成或破壞細胞壁結構的抗生素等因素的作用下，可發(fā)生細胞壁缺陷和形成L型［6］。細胞壁缺陷造成細菌喪失了抗生素作用的靶位，因此可對干擾細胞壁合成的抗菌藥物形成非遺傳性耐藥性［6］。本文結果顯示，中高濃度的異煙肼、利福平、乙胺丁醇對結核分枝桿菌細菌型具有抑制和殺滅作用，同時可誘導結核分枝桿菌L型形成并且獲得耐藥性。提示結核分枝桿菌是容易發(fā)生細胞壁缺陷的細菌，其可在許多因素的作用下發(fā)生細胞壁缺陷變異和成為L型。與王和等［7］實驗結果相比，低濃度抗結核藥物不能對結核分枝桿菌的細菌型產生抑制和殺滅作用，也不能誘導形成結核分枝桿菌L型形成，有可能與抗結核藥物的濃度低于其對結核分枝桿菌的抑菌濃度有關，這有待試驗進一步證實。濃度升高后抗結核藥物顯現(xiàn)出對結核分枝桿菌的抑制作用，同時也導致L型形成，L型的產生使結核分枝桿菌形成對利福平、異煙肼、乙胺丁醇的耐藥，這樣不但可導致臨床抗結核藥物治療無效，而且也可造成結核分枝桿菌在宿主體內潛伏存在和形成結核的潛在帶菌者與傳染源。

結核分枝桿菌L型可長期潛伏于宿主體內導致疾病進入慢性過程，在一定條件下可以返祖造成結核病復發(fā)。本文結果可見，結核分枝桿菌L型對氨基糖甙類、喹諾酮等抗菌藥物敏感。胡忠義［8］報道結核分枝桿菌L型對鏈霉素、紅霉素、氧氟沙星、諾氟沙星等抗菌藥物均敏感，而對傳統(tǒng)的抗結核藥物利福平、異煙肼、乙胺丁醇不再敏感。張世馥等［9］、馬筱玲等［10］經實驗證實結核分枝桿菌轉變?yōu)長型后致病性大為減輕，引起的癥狀與病理變化很不典型，在臨床上容易引起漏診與誤診。以上這些因素有可能導致結核分枝桿菌L型長期潛伏體內，并導致疾病呈慢性過程或復發(fā)、惡化。馬筱玲等［11］經實驗證實，結核分枝桿菌細菌型與L型之間能相互變換，L型菌在一定條件下可逐漸回復成典型分枝桿菌，這也說明結核分枝桿菌L型是結核感染過程中持續(xù)存在的一種型式。結核分枝桿菌L型與結核病復發(fā)、惡化有一定關系［12］。若在患者就診時同時進行細菌型和L型培養(yǎng)，并對結核分枝桿菌L型培養(yǎng)陽性結核患者進行抗結核分枝桿菌L型治療，對提高結核病治愈率，減少復治或復發(fā)可能有一定的幫助。

［1］Golanov VS，Meshcheriakov VG.Differential diagnostic value of detecting L-forms of Mycobacterium tuberculosis［J］.Probl Tuberk，1994，(4):27-28.

［2］Dorozhkova IR，Zemskova ZS，Krudu VN.L-transformation of mycobacteria in the light of current epidemiological situation of tuberculosis in the world［J］.Vestn Ross Akad Med Nauk，1995，(7):30-33.

［3］王和，羅振華，徐艷，等.細胞壁缺陷結核分枝桿菌耐藥性的基因研究［J］.中國抗生素雜志，2007，32(10):636-640.

［4］中華結核和呼吸雜志委員會.結核分支桿菌L型的檢測方法(試行)［J］.中華結核和呼吸雜志，2003，26(2):67-69.

［5］楊藻宸.醫(yī)用藥理學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1994:904-909.

［6］Brooks GF，Butel JS，Morse SA.Medical Microbiology［M］.Beijing:People Health Publishing House，2001:28，148-149.

［7］王和，陳崢宏.抗結核藥物誘導結核分支桿菌形成L型及其特性的觀察［J］.中華結核和呼吸雜志，2001，24(1):52-55.

［8］胡忠義.我國結核分支桿菌L型實驗研究現(xiàn)狀與亟待解決的問題［J］.中華結核和呼吸雜志，2002，25(10):583-585.

［9］張世馥，洪先知，王萍，等.抗酸菌L型感染病理和臨床誤診的研究［J］.中華結核和呼吸雜志，1994，17(3):159-161.

［10］馬筱玲，黃谷良，林特夫，等.結核分枝桿菌L型致病性的實驗研究［J］.中國微生態(tài)學雜志，1995，7(1):1-3.

［11］馬筱玲，黃谷良，林特夫.恥垢分枝桿菌發(fā)育過程中多形性觀察［J］.中國微生態(tài)學雜志，1993，5(1):14-17.

［12］黃燊德，黃鳳賢，湯志強.結核分枝桿菌L型與肺結核復發(fā)的研究［J］.實用醫(yī)學雜志，2010，6(26):977-978.