蛋白印跡技術(shù)的優(yōu)化

李 濤，朱玉楠，韓延杰，王芳芳，賀雅靜，曹承華，施中東，程相樹(shù)，姬新穎，何 敏

（1 河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 河南省抗體藥物工程實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封 475004；2 河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院 內(nèi)科教研室，河南 安陽(yáng) 455000）

蛋白印跡技術(shù)的優(yōu)化

李 濤1，朱玉楠1，韓延杰1，王芳芳1，賀雅靜1，曹承華1，施中東1，程相樹(shù)1，姬新穎1，何 敏2＊

（1 河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 河南省抗體藥物工程實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封 475004；2 河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院 內(nèi)科教研室，河南 安陽(yáng) 455000）

蛋白印跡是細(xì)胞和分子生物學(xué)研究中重要的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。利用蛋白印跡技術(shù)可以檢測(cè)細(xì)胞或組織裂解液中的特異性蛋白，特別是微量蛋白的檢測(cè)，并進(jìn)行定性及定量的分析。自1979年科學(xué)家發(fā)明了將蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠電泳移植到生物膜后，蛋白印跡技術(shù)得到了極大的發(fā)展，目前科學(xué)界有各種形式的印跡方法。我們就如何優(yōu)化蛋白印跡提高成功率做一介紹。

蛋白印跡；蛋白；轉(zhuǎn)??；SDS－PAGE

蛋白印跡（Western blotting）又稱(chēng)免疫印跡，是繼DNA印跡［1］和RNA印跡［2］之后發(fā)展起來(lái)的一種重要的用于蛋白質(zhì)分離及鑒定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是利用蛋白樣品中分子量的不同而將蛋白質(zhì)分離，然后從SDS凝膠中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到具有吸附作用的纖維膜上［3］，將含有蛋白的纖維膜放在有熒光標(biāo)記的抗體中進(jìn)行孵育［4］，最后得到被分開(kāi)的蛋白的條帶。蛋白印跡的敏感性主要取決于轉(zhuǎn)印和抗體的結(jié)合能力等［5］。在操作過(guò)程中任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)失誤都會(huì)使蛋白印跡的敏感性降低。

1 細(xì)胞的培養(yǎng)和收集

蛋白印跡成功的關(guān)鍵是所得蛋白質(zhì)量的高低［6］，高質(zhì)量的蛋白質(zhì)需要良好的細(xì)胞狀態(tài)。具體方法有：①如果培養(yǎng)瓶中有細(xì)胞碎片，可把細(xì)胞低速離心（600g，6min），換新瓶繼續(xù)培養(yǎng)。② 細(xì)胞自身會(huì)分泌一些生長(zhǎng)因子，如果細(xì)胞狀態(tài)不好，不必天天換液，否則，生長(zhǎng)因子將丟失。③ 如果細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，可將血清濃度增加至15%。④培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞密度要適宜，一般培養(yǎng)瓶中含有50%～70% 的細(xì)胞較易生長(zhǎng)。

收集細(xì)胞的前一天給細(xì)胞換一次液，第二天細(xì)胞則處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此期的細(xì)胞含的蛋白量較多質(zhì)量也最好。收集細(xì)胞后用1×PBS洗2遍，立即裂解或置－80℃冰箱進(jìn)行凍存，時(shí)間不超過(guò)2周。

2 蛋白樣品的處理

2.1 細(xì)胞的裂解

向收集的細(xì)胞中加入其4倍體積的細(xì)胞裂解液，按照50∶1的比例加入蛋白酶抑制劑，使其充分混合。用加樣器反復(fù)吹打細(xì)胞，協(xié)助其充分裂解，冰置30min。將離心機(jī)溫度降至4℃，12000r／min，離心10min，小心吸取上清置另一干凈的EP管中。

2.2 蛋白濃度的測(cè)定

用BCA方法測(cè)蛋白濃度，具體操作步驟如下：①稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。見(jiàn)表1。②配制BCA工作液。根據(jù)所測(cè)的樣品的數(shù)量，按照50∶1的比例將A液和B液混合均勻，冰置待用。③將A～G的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白各吸取25μL加入96孔板中。④加入200μL的A、B混合液，混合均勻，置37℃恒溫箱中30min。⑤用酶標(biāo)儀在560nm處測(cè)吸光度。⑥根據(jù)吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白濃度。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表

2.3 蛋白樣品的變性

進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)時(shí)，所需的蛋白質(zhì)是變性的［7］，因此要加入5×SDS－PAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）緩沖液和1×SDS－PAGE緩沖液，使同一組的樣品在相同的體積內(nèi)含有相同含量的蛋白。之后煮沸5min，冰置1min，4℃，12000r／min，離心5min。

3 SDS－PAGE膠的配制

3.1 凝膠配制

將凝膠裝置、玻璃板、梳子等清洗干凈，并用雙蒸水沖洗，晾干后備用。將一套玻璃板疊放整齊后加入凝膠裝置中，并固定，以避免漏膠，向玻璃板中加入雙蒸水檢驗(yàn)裝置是否漏水（約10min）。配制10mL 120g／L分離膠，混合均勻后，快速加入玻璃板中，避免氣泡產(chǎn)生，加至距梳子齒1cm的地方，小心地用雙蒸水加滿(mǎn)，使膠面保持較平整，置37℃恒溫箱中使之凝固。配制3mL 50g／L濃縮膠，混合均勻后，加入分離膠的上面，加滿(mǎn)后，將梳子小心地插入玻璃板中，置37℃恒溫箱中或常溫凝固。膠凝固后，加入蛋白電泳緩沖液，待用。

3.2 注意事項(xiàng)

①按順序加入凝膠的各個(gè)成分，充分混合均勻，否則會(huì)影響條帶的形狀。②玻璃板內(nèi)的凝膠不要有氣泡，如果有氣泡產(chǎn)生，可用洗耳球輕輕敲打玻璃板將氣泡趕出。③兩手持梳子的兩側(cè)邊緣，均勻的將梳子拔出，否則梳子孔會(huì)傾斜，在拔梳子的過(guò)程中如果梳子孔出現(xiàn)傾斜，用細(xì)的注射器針頭撥正即可；④凝膠要現(xiàn)用現(xiàn)配，如果放置時(shí)間長(zhǎng)，凝膠會(huì)發(fā)生收縮而影響條帶的質(zhì)量。

4 電泳和轉(zhuǎn)印

4.1 垂直電泳

在電泳裝置的正負(fù)極加入電泳緩沖液后，將處理好的蛋白樣品小心加入加樣孔中，同時(shí)一個(gè)孔加入3μL蛋白 Marker作為對(duì)照。打開(kāi)電源，調(diào)電壓至80V，連接電泳裝置，蛋白樣品首先在濃縮膠中被壓縮，當(dāng)?shù)鞍讟悠愤M(jìn)入分離膠時(shí)，將電壓調(diào)至120V，目的是根據(jù)蛋白分子量的不同使蛋白樣品分開(kāi)。當(dāng)?shù)鞍讟悠放艿椒蛛x膠的底部時(shí)，可以切斷電源。

垂直電泳要注意：①正極的電泳液要漫過(guò)內(nèi)側(cè)的玻璃板。②加樣器吸取樣品時(shí)不要有氣泡，加樣時(shí)不可太快，否則會(huì)使樣品溢出，影響上樣的一致性；③加不同的樣品時(shí)，要換加樣器針頭，或?qū)⒓訕悠髟谕怆娪静壑邢礈?次，以免交叉污染。

4.2 轉(zhuǎn)印

當(dāng)樣品跑到膠的底部時(shí)，要及時(shí)轉(zhuǎn)膜，放置的時(shí)間不可太長(zhǎng)，沒(méi)有電流通過(guò)時(shí)，蛋白在凝膠中容易發(fā)生彌散。轉(zhuǎn)膜分干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)，我們一般用的是濕轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜時(shí)，轉(zhuǎn)膜夾子的黑面朝下（默認(rèn)為負(fù)極），從下到上依次為：1層海綿 —3層濾紙 — 凝膠 —PVDF膜—3層濾紙 —1層海綿。

具體方法為將跑完樣品的玻璃板卸下，清水沖洗電泳液，用尺子沿玻璃板的邊緣將玻璃板撬開(kāi)，注意不要將膠弄破。用試管盛取少量轉(zhuǎn)膜液沖洗膠的表面，將3層濾紙重疊好，用轉(zhuǎn)膜液浸濕后壓為1層。左手持帶有膠的玻璃板（此時(shí)膠上一定要保證有一定量的轉(zhuǎn)膜液，以便和濾紙吸附），右手持搟壓好的濾紙，將濾紙的邊緣與膠的邊緣對(duì)齊，將濾紙貼在膠上，左手將玻璃板翻轉(zhuǎn)，將膠從玻璃板上剝離下來(lái)，此時(shí)濾紙和膠會(huì)落在左手掌中，利用此種辦法可以保證膠不會(huì)損毀。將濾紙向下置海綿上，左手輕壓膠上的Marker部位，右手持小試管在膠上輕輕地?fù){壓，以趕走濾紙和膠中間的氣泡。在膠上均勻的鋪1層轉(zhuǎn)膜液，將處理好的PVDF膜用鑷子夾住沿膠的一邊，輕置膠上，用上述同樣的方法將膠和PVDF膜之間的氣泡趕走。在PVDF膜上鋪上1層轉(zhuǎn)膜液，將另外3層濾紙搟壓為1層后輕置PVDF膜上，用同樣方法趕走2層之間的氣泡。蓋1層海綿，夾緊，黑色面朝向負(fù)極放在轉(zhuǎn)膜槽中，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。一般用恒流400mA，1～1.5h即可。

轉(zhuǎn)膜注意事項(xiàng)：①甲醇浸泡PVDF膜1min，加入適量的轉(zhuǎn)膜液置搖床10min，使膜充分活化。②濾紙、凝膠、PVDF膜的大小一致，否則會(huì)影響電流的通過(guò)。③2塊海綿要用轉(zhuǎn)膜液浸濕。④轉(zhuǎn)膜液4℃存放，溫度過(guò)高會(huì)影響轉(zhuǎn)膜效果。⑤轉(zhuǎn)膜時(shí)正、負(fù)極不要放錯(cuò)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電，要保證凝膠靠近負(fù)極，PVDF膜靠近正極；⑥新配的轉(zhuǎn)膜液，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1h，用3次以上，轉(zhuǎn)膜的時(shí)間要相應(yīng)延長(zhǎng)至1.5h；⑦凝膠不分正反面，PVDF膜的正面為緊挨著凝膠的一面。

5 免疫反應(yīng)和顯影定影

5.1 免疫反應(yīng)

將膜正面向上置大小適合的玻璃皿中，清水輕涮2遍，后用封閉液（TBST加入50g／L的脫脂奶粉）常溫封閉1h。封閉抗體前用TBST將PVDF膜洗5min。根據(jù)需要可把膜剪開(kāi)，以便封不同的抗體。封一抗時(shí)要讓膜完全浸泡在一抗溶液中，封好后常溫置搖床1h，低速，1～2擋以便一抗和目的蛋白充分結(jié)合。一抗在常溫下可以封閉3h，也可以4℃過(guò)夜。

將封過(guò)一抗的膜用TBST涮洗3遍（5min／遍），涮洗時(shí)搖床調(diào)至6～7擋，洗膜時(shí)水平搖床，使膜在玻璃皿中受力一致，膜的各個(gè)部位洗的比較均勻。旋轉(zhuǎn)式搖床，膜的兩邊受到的轉(zhuǎn)速較大，中間的轉(zhuǎn)速較小，易造成膜的兩邊洗的較重，中間洗的較輕，所得誤差較大。

二抗稀釋液為T(mén)BST加入5g／L的脫脂奶粉配制而成。常用的二抗有鼠二抗、兔二抗、山羊二抗等。同封一抗相同，室溫，置搖床1h，以保證二抗能與一抗充分結(jié)合。用TBST涮膜后洗3遍（7min／遍），搖床調(diào)至6～7擋。

注意事項(xiàng)：①洗膜時(shí)，保證一張膜一個(gè)玻璃皿，否則膜之間會(huì)發(fā)生摩擦，把結(jié)合的抗體磨掉。②洗膜時(shí)最好在水平搖床上進(jìn)行。③膜的兩端一定要保證有一小段膜是空白的，這樣既便于夾膜，又可對(duì)里面的蛋白起保護(hù)作用。④在夾取膜時(shí)盡量不要夾有蛋白的地方。

5.2 顯影定影

根據(jù)膜的大小配制發(fā)光劑（穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑按1∶1的比例配制）。將膜的正面置廢膠片上，將發(fā)光劑均勻地涂在膜上，反應(yīng)40～50s后將膜置吸水紙上吸除多余的發(fā)光劑，用保鮮膜將膜包好，正面向上固定在暗盒內(nèi)。在暗室內(nèi)將顯影液和定影液分別置容器內(nèi)，取出膠片，右下折角作為標(biāo)記，將膠片置暗盒內(nèi)，根據(jù)條帶的強(qiáng)弱調(diào)整曝光的時(shí)間，一般從5s～10min。膠片首先置顯影液中1min，清水沖洗，后置定影液中1min，清水沖洗，吹風(fēng)機(jī)吹干膠片，留以分析。

曝片時(shí)注意事項(xiàng)：①涂發(fā)光液后，要迅速將膠片壓在膜上，因?yàn)榘l(fā)光液的發(fā)光時(shí)間成拋物線的形式，最好在其發(fā)光剛起步時(shí)壓上片子，使曝出來(lái)的條帶沒(méi)有背景色。②在顯影和定影時(shí)需輕輕晃動(dòng)膠片，盡量拿膠片一角，手指不要?jiǎng)潅z片，以免影響結(jié)果。

6 結(jié)論

蛋白印跡是一種檢測(cè)蛋白的技術(shù)手段。此技術(shù)不斷向前發(fā)展，目前在轉(zhuǎn)印、免疫檢測(cè)方面取得了突破性進(jìn)展，雙轉(zhuǎn)印法［8］、組織切片轉(zhuǎn)?。?］、天然電泳［10］、網(wǎng)格式免疫轉(zhuǎn)?。?1］、多重抗原印跡［12］等轉(zhuǎn)印技術(shù)的出現(xiàn)給蛋白印跡的發(fā)展拓寬了思路。盡管新型蛋白印跡的發(fā)展十分迅速，但是基礎(chǔ)的免疫印跡在細(xì)胞和分子生物學(xué)的研究中卻十分普遍。通過(guò)上述對(duì)蛋白印跡每一操作步驟的優(yōu)化，能更容易、更直接的了解蛋白印跡的精髓所在，熟練每一操作步驟的關(guān)鍵及注意事項(xiàng)，以便能在短時(shí)間內(nèi)掌握操作要領(lǐng)并成功得到所要的結(jié)果。

7 溶液配方

Western Blotting中用到液體的配方：①1×PBS Buffer（1L，pH＝7.4）：NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO41.42g；KH2PO40.27g。②1×細(xì)胞裂解液（1L）：HEPES 4.766g；NaCl 8.766g；MgCl22.033g；體積分?jǐn)?shù)為5%Triton ×－1005mL；SDS 1g。③1×一抗稀釋液（10mL）：BSA 0.1g；NaN30.01g；1×PBS 10mL。④ 5×SDS－PAGE Buffer（10mL）：Tris－Hcl（pH ＝6.8）0.6mL；體積分?jǐn)?shù)為50%甘油 5mL；100g／L SDS 2mL；β－巰基乙醇0.5mL；10g／L 溴酚藍(lán) 1mL；ddH2O 0.9mL。⑤1×SDS－PAGE電泳緩沖液（1L）：Tris 3.03g；Glycine 18.77g；SDS 1g。⑥ 1×轉(zhuǎn)膜緩沖液（1L）：Glycine 11.25g；Tris 2.375g；SDS 0.37g；甲醇200mL；ddH2O 定容至1L。⑦1×TBST溶液（1L）：Tris 12.114g；NaCl 8.8g；ddH2O 800mL，用濃HCl調(diào)至pH＝7.5，定容1L，用時(shí)再加入吐溫－20至體積分?jǐn)?shù)為0.5%。⑧ 顯影液（500mL）：dH2O 365.25mL；A 液 125mL；B 液 5.1mL；C 液4.875mL。⑨ 定影液（500mL）：dH2O 363.5mL；A液125mL；B液11.5mL。

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［責(zé)任編輯 姬 荷］

The optimization of Western blotting

LI Tao1，ZHU Yunan1，HAN Yanjie1，WANG Fangfang1，HE Yajing1，CAO Chenghua1，SHI Zhongdong1，CHENG Xiangshu1，JI Xinying1，HEmin2＊（1.Henan Provincial Key Engineering Laboratory for Antibody Medicine，School of Medicine，Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2.Henan Vocational College of Nursing，Anyang，Henan 455000，China）

Western blotting is an important test technique used in the researching cell and molecular biology.By using the western blotting ，researchers can detect special proteins，particularly those that are of low abundance，from the complex mixture of proteins extracted from cells and tissues，and then make qualitative and quantitative analysis.Since scientists invented the protocol for protein transfer from an electrophoresed gel to a membrane in 1979，protein blotting has gained great developments.Now，in scientific community there are all kinds of means to transfer.So this paper describes how to optimize western blotting to improve the success rate.

Western blotting；protein；transfer；SDS PAGE

Q51

A

1672－7606（2014）02－0141－04

2014－01－25

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81071327，81270142）；河南省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目（11430051026）；河南省科技廳重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（112102310269）。

李濤（1964年－），女，陜西蒲城人，實(shí)驗(yàn)師，從事分子生物學(xué)的教學(xué)和科研工作。

＊通訊作者：何敏（1964－），女，河南林州人，副教授，從事分子生物學(xué)的教學(xué)和科研工作。