靶向TIPE2基因的shRNA慢病毒載體構(gòu)建及病毒包裝

王耀輝，王明麗，陳九格，張 晶，馬遠(yuǎn)方

（河南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 開(kāi)封 475004）

靶向TIPE2基因的shRNA慢病毒載體構(gòu)建及病毒包裝

王耀輝，王明麗，陳九格，張 晶，馬遠(yuǎn)方＊

（河南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 開(kāi)封 475004）

目的包裝表達(dá)TIPE2－shRNA的慢病毒顆粒。方法查詢并合成7對(duì)針對(duì)TIPE2的shRNA序列，將其克隆入pLK0.1載體，經(jīng)酶切及測(cè)序正確后，將構(gòu)建好的7種pLKO.1－TIPE2－shRNA質(zhì)粒分別與pCDNA3.1／3×FLAG－TIPE2共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western blot鑒定干擾效率并進(jìn)行后續(xù)的病毒包裝。結(jié)果4號(hào)質(zhì)粒沉默效果最好，將其與Non－target－shRNA質(zhì)粒分別進(jìn)行病毒包裝，Western blot和免疫熒光證實(shí)病毒具有良好的感染效率和沉默效果。結(jié)論TIPE2－shRNA的慢病毒載體構(gòu)建及病毒包裝成功。

TIPE2；shRNA；慢病毒包裝；基因

TIPE2（tumor necrosis factora induced protein－8－like 2，TNFAIP8L－2）隸屬于 TNFAIP8家族，它由184個(gè)氨基酸組成，在維持機(jī)體免疫平衡中扮演重要角色。研究［1］表明，TIPE2優(yōu)先表達(dá)于淋巴組織，敲除TIPE2后會(huì)使老鼠體內(nèi)多器官功能障礙，脾臟腫大，甚至過(guò)早死。在人體內(nèi)，除免疫細(xì)胞外，TIPE2還在神經(jīng)細(xì)胞、宮頸、胃腸道的上皮細(xì)胞中表達(dá)［2］，由此說(shuō)明，TIPE2可能參與體內(nèi)多方面生理功能調(diào)節(jié)。我們的實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建攜帶TIPE2基因shRNA的慢病毒載體，包裝高效的慢病毒顆粒，為進(jìn)一步研究TIPE2功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、載體和質(zhì)粒 Huh7人肝癌細(xì)胞系、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、HEK293T人胚腎細(xì)胞系（實(shí)驗(yàn)室保存）；第三代慢病毒表達(dá)載體pLKO.1、慢病毒包裝載體psPAX2、pMD2.G 及對(duì)照載體 Non－targetshRNA（自帶綠色熒光蛋白）（復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院袁正宏教授饋贈(zèng)）；pCDNA3.1／3×FLAG－TIPE2質(zhì)粒（實(shí)驗(yàn)室制備）。

1.1.2 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó) Life Technologies公司）；PEI（實(shí)驗(yàn)室制備）；Puromycin（美國(guó) Sigma－Aldrich公司）；限制性內(nèi)切酶（加拿大Fermentas公司）；T4連接酶及Buffer（日本Takara公司）；金牌超量無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；膠回收試劑盒（美國(guó) Axygen公司）；倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）；ImageQuant350（美國(guó) GE公司）。

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸設(shè)計(jì)與合成 從Sigma頁(yè)面（http：／／www.sigmaaldrich.com／catalog／mission／shclnvnm024575？lang＝en＆region＝AS）查找并挑選7對(duì)針對(duì)TIPE2基因的shRNA寡核苷酸序列并進(jìn)行合成（蘇州金唯智生物科技有限公司）。

1.2.2 構(gòu)建與鑒定sh－TIPE2慢病毒表達(dá)載體pLKO.1載體經(jīng)EcoRI、Age I兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切后膠回收，并將退火后的7對(duì)shRNA序列與膠回收產(chǎn)物在16℃連接4h，用DH5α轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，涂板后置37℃溫箱孵育12h，次日挑取飽滿單克隆搖菌過(guò)夜，然后用金牌超量無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒；質(zhì)粒經(jīng)EcoRI、NcoI雙酶切及測(cè)序（蘇州金唯智生物科技有限公司）鑒定后正確。將pCDNA 3.1／3×FLAG－TIPE2和構(gòu)建好的7種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞并進(jìn)行 Western blot檢測(cè)，以蛋白表達(dá)降低50%視為干擾有效。

1.2.3 慢病毒包裝制備 培養(yǎng)293T細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染前一天接種于10cm培養(yǎng)皿內(nèi)，待細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)即用PEI進(jìn)行轉(zhuǎn)染。體系如下：在1.5mL EP管內(nèi)加入9g／L NaCl 480μL、PEI 20μL，輕彈混勻，于另一1.5mL EP管內(nèi)加入 Non－targe－shRNA 5 μg、psPAX23.75μg、pMD2.G 1.25μg，9g／L NaCl補(bǔ)足500μL，混勻。5min后把前者加入后者混勻，期間對(duì)培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基，20min后把混合液均勻加入培養(yǎng)皿混勻；pLKO.1－TIPE2－shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染如上。轉(zhuǎn)染24h后更換培養(yǎng)基，72h后收集富含病毒顆粒培養(yǎng)上清，離心（800g，5min，25 ℃）后用0.45μm濾膜過(guò)濾，分裝后于 －80℃保存。

1.2.4 病毒感染與檢測(cè) 用293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNA3.1／3×FLAG－TIPE2表達(dá)質(zhì)粒，48h后取部分細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞密度達(dá)到60%時(shí)，用包裝后的病毒與培養(yǎng)基按1∶1比例感染細(xì)胞，其中以Mock和Non－target－shRNA病毒顆粒為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。24h后棄上清，收細(xì)胞，并用Western blot檢測(cè)病毒感染效果。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：配置150g／L SDSPAGE，取10μL蛋白樣品上樣，分離膠14mA，濃縮膠18mA條件下跑膠，之后濕轉(zhuǎn)至NC膜（300mA，1h）；50g／L的脫脂奶粉封閉1h，洗膜（10min／次，3次）；一抗室溫封閉2h ［anti－β－actin（1∶10000），anti－FLAG（1∶3000）］，洗膜，二抗山羊抗鼠－HRP（1∶3000）、山羊抗兔－HRP（1∶3000）室溫孵育2h，洗膜；用ECL發(fā)光液于暗室曝光。

2 結(jié)果

2.1 引物設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)7對(duì)針對(duì)TIPE2的shRNA特異性引物（表1），用高壓滅菌水溶解為終濃度20μmon／L，按照正義引物 5μL、反義引物 5μL、10×NEB Buffer25μL、H2O 35μL的配比混合均勻，置于1L裝滿水的燒杯中，加熱至95～100℃，放置4～5min，緩慢降溫至室溫（2h左右），將合成的單鏈寡核苷酸退火形成具有黏性末端的寡核苷酸雙鏈（58bp）。

表1 TIPE2－shRNA引物序列

續(xù)表1

2.2 pLKO.1－TIPE2－shRNA 慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

經(jīng)EcoRI、Age I兩種內(nèi)切酶酶切后的慢病毒表達(dá)載體pLKO.1與退火后具有黏性末端的7對(duì)TIPE2－shRNA片段進(jìn)行定向連接，轉(zhuǎn)化后提質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI，NcoI酶切，在2kb及5kb處有與預(yù)期一致的條帶（圖1），測(cè)序鑒定正確。將pCDNA3.1／3×FLAG－TIPE2質(zhì)粒與構(gòu)建好的7個(gè) TIPE2－shRNA質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，經(jīng) Western blot驗(yàn)證4號(hào)質(zhì)粒干擾效果最好。

2.3 病毒包裝與鑒定

將4號(hào)質(zhì)粒pLKO.1－TIPE2－shRNA 和 Non－target－shRNA質(zhì)粒分別與慢病毒包裝載體共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞。用包裝后含 Non－target－shRNA、TIPE2－shRNA的病毒顆粒分別感染轉(zhuǎn)染有pCDNA3.1／3×FLAG－TIPE2表達(dá)質(zhì)粒的293T細(xì)胞，前者于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)絕大部分細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白（圖2）；后者收集細(xì)胞經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，病毒感染后TIPE2蛋白水平顯著下調(diào)（圖3）。

圖1 pLKO.1－TIPE2－shRNA質(zhì)粒酶切后

圖2 熒光顯微鏡檢測(cè)慢病毒感染效率（×100）

圖3 Western blot檢測(cè)慢病毒感染后的沉默效果

3 討論

TIPE2于2002年作為新基因被發(fā)現(xiàn)［3］，是TNFAIP8家族的一員，二者在結(jié)構(gòu)方面相似，都可調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫，在維持免疫自穩(wěn)中具有重要作用。有研究［4］表明，TIPE2在肝癌組織中低表達(dá)，沉默TIPE2會(huì)顯著激活Ras下游信號(hào)，從而抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞遷移，提示TIPE2可能參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。此外，敲除TIPE2的動(dòng)物更易患敗血癥休克［1］，這就提示TIPE2可能參與體內(nèi)多方面功能調(diào)節(jié)，而這需要更深入研究來(lái)揭示。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，RNA干擾技術(shù)在研究基因功能方面具有重要作用。RNA干擾是利用雙鏈RNA高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)，使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型的過(guò)程［5］。但細(xì)胞內(nèi)siRNA易降解不利于對(duì)基因功能長(zhǎng)期研究，而病毒感染可彌補(bǔ)這一缺陷，易于篩選穩(wěn)定細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期研究。病毒包裝常用載體之一慢病毒載體具有感染分裂期、非分裂期細(xì)胞，目的基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)，不易誘發(fā)免疫反應(yīng)等特點(diǎn)，可以作為理想載體攜帶shRNA［6］。

我們的研究成功構(gòu)建了 pLKO.1－TIPE2－shRNA慢病毒表達(dá)載體，并包裝高感染效率的慢病毒顆粒，這為今后研究TIPE2功能奠定了良好基礎(chǔ)。

［1］Sun H ，Gong S，Carmody R J，et al.TIPE2，a negative regulator of innate and adaptive immunity that maintains immune homeostasis［J］.Cell，2008，133（3）：415－426.

［2］Xi W，Hu Y，Liu Y，et al.Roles of TIPE2in hepatitis B virus induced hepatic inflammation in humans and mice［J］.Mol Immunol，2011，48（9／10）：1203－1208.

［3］Hansson G K.Immune mechanisms in atherosclerosis［J］.Nat Immunol，2001，21（12）：1876－1890.

［4］Gus－Brautbar Y，Johnson D，Zhang L，et al.The anti－inflammatory TIPE2is an inhibitor of the oncogenic Ras［J］.Mol Cell，2012，45（5）：610－618.

［5］Moffat J，Sabatini D M.Building mammalian signalling pathways with RNAi screens［J］.Nat Revmol Cell Biol，2006，7（3）：177－187.

［6］Nishitsuji H，Ikeda T，Miyoshi H，et al.Expression of small hairpin RNA by lentivirus－based vector confers efficient and stable gene－suppression of HIV－1on hum an cells including primary non－dividing cells［J］.Microbes Infect，2004，6（1）：76－85.

［責(zé)任編輯 姬 荷］

Construction and package of recombinant lentivirus expressing shRNA targeting TIPE2 gene

WANG Yaohui，WANGmingli，CHEN Jiuge，ZHANG Jing，MA Yuanfang＊（Medical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China）

ObjectiveTo package the recombinant lentivirus expressing TIPE2shRNA.MethodsInquiring and synthesizing seven pairs shRNA sequences targeting TIPE2，then inserted into pLKO.1lentivirus vector.After the constructions were verified to be correct，co－transfected them with pCDNA3.1／3×FLAG TIPE2plasmids into 293T cells，respectively.Then，Non target shRNA，the highest silence efficiency plasmid were co－transfected with psPAX2，pMD2.G into 293Tcells for lentivirus packaging，respectively.ResultsThe No.4plasmid was screened by Western blotting that has the highest silence efficiency and followed by virus packing.The infection and silence efficiency was confirmed by immunofluorescence and Western blot.ConclusionThe recombinant lentivirus expressing shRNA targeting TIPE2gene was packaged successfully.

TIPE2；shRNA；lentivirus package；gene

Q782

A

1672－7606（2014）02－0120－03

2014－02－15

河南大學(xué)校內(nèi)基金資助（2011YBZR005）。

王耀輝（1982－），男，河南許昌人，博士，講師，從事病毒與宿主相互作用及抗體藥物研發(fā)的教學(xué)與科研工作。

＊通訊作者：馬遠(yuǎn)方（1960－），男，河南鞏義人，博士，教授，從事免疫學(xué)及分子免疫學(xué)的教學(xué)及科研工作。