人TRAIL胞外區(qū)原核可溶性表達及活性鑒定

鮑應環(huán)，程相樹，劉峰濤

（河南大學醫(yī)學院 細胞與分子免疫學實驗室，河南 開封 475004）

人TRAIL胞外區(qū)原核可溶性表達及活性鑒定

鮑應環(huán)，程相樹，劉峰濤＊

（河南大學醫(yī)學院 細胞與分子免疫學實驗室，河南 開封 475004）

目的獲得具有生物活性的腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）胞外段蛋白。方法根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛性要求，設計合成編碼TRAIL胞外段的DNA序列，構(gòu)建成pET30a－TRAIL胞內(nèi)融合表達質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主E.coli BL21。在不同溫度、不同濃度的IPTG條件下誘導表達TRAIL，SDS－PAGE分析表達產(chǎn)物，MTT法檢測產(chǎn)物活性。結(jié)果構(gòu)建的工程菌株表達29KD的可溶性TRAIL融合蛋白，能誘導Jurkat細胞凋亡。結(jié)論成功表達了人TRAIL胞外段蛋白，為進一步研究提供基礎。

TRAIL；原核表達；Jurkat細胞；凋亡

腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TNF－related apoptosis－inducing ligand，TRAIL）是 TNF 超家族成員，可選擇性的誘導腫瘤細胞、病毒感染細胞和轉(zhuǎn)化細胞凋亡而對正常細胞無毒［1－3］，因此具有被開發(fā)成治療腫瘤的蛋白質(zhì)藥物的可能性。其分子機制是受體DR4或DR5結(jié)合后誘發(fā)TRAIL發(fā)生三聚化并起始細胞凋亡途徑［4］。之前已有多人［5－6］通過不同方式構(gòu)建TRAIL的原核表達載體，并獲得目的蛋白，但目的蛋白多以包涵體的形式表達。我們的實驗根據(jù)大腸桿菌表達的密碼子偏愛性，優(yōu)化編碼TRAIL（114～281氨基酸）的基因，人工合成重組基因，構(gòu)建在表達質(zhì)粒pET30a上，直接獲得可溶性TRAIL。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Jurkat細胞、E.coli top10菌株、E.coli BL21菌株和pET30a載體（實驗室保存）；2000bp loading DNA marker、蛋白質(zhì) marker和T4連接酶（日本Takara公司）；HandⅢ 限制性內(nèi)切酶和BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶（英國NEB公司）；MTT（安徽省合肥市 Biosharp公司）；LB培養(yǎng)基（5g／L Yeast Extract，10g／L Tryptone，10g／L NaCl）、1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清（實驗室提供）；TRAIL基因片段根據(jù)氨基酸序列，進行密碼子優(yōu)化 （青蘭生物公司合成）。

1.2 方法

1.2.1 基因的合成和酶切位點的設計 按照大腸桿菌表達的偏愛密碼子設計并人工合成編碼114～281氨基酸的整段DNA序列，并將其克隆入pUC19載體。

1.2.2 TRAIL表達菌株的構(gòu)建 利用HandⅢ 和BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶雙酶切pUC19－TRAIL質(zhì)粒、pET30a載體質(zhì)粒，膠回收TRAIL、載體片段，連接過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞；挑取陽性克隆，測序鑒定。

1.2.3 TRAIL工程菌誘導表達及表達條件優(yōu)化取測序鑒定正確的pET30a－TRAIL質(zhì)粒接種3mL LB液體培養(yǎng)基，增菌至OD600為0.4，加入終濃度分別為0、0.1、0.4、0.6、1.0mmol／L的IPTG，30 ℃誘導4h，25℃不加乙醇誘導過夜，25℃加體積分數(shù)為5%的乙醇誘導過夜等條件誘導后收集全部菌體超聲破碎，分離上清和沉淀，上清和沉淀包涵體分別溶于200μL的PBS和200μL濃度為8mol／L的尿素。120g／L SDS－PAGE電泳分析上清和沉淀（上樣量均為20μL）。

1.2.4 TRAIL蛋白純化及鑒定 His柱純化上清：500mmol／L咪唑洗脫，純化產(chǎn)物超濾法置換buffer并濃縮，BCA法測濃度，過濾除菌，30%甘油－20℃保存。

1.2.5 生物活性鑒定 含體積分數(shù)為10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基配置Jurkat細胞懸液，濃度為1×106／mL，96孔板每孔加0.2mL。細胞鋪板后，立刻加入TRAIL，濃度梯度為0、1、2、5、10mg／L，每組設3個復孔。37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)24h，離心吸出培養(yǎng)液加入50μL濃度為2g／L的MTT，培養(yǎng)4h。2500r／min，離心，吸出多余 MTT，加入150μL DMSO，振蕩10min，490nm波長測定各孔的光密度值。

2 結(jié)果

2.1 TRAIL蛋白誘導表達及條件優(yōu)化

結(jié)果顯示，不同溫度和IPTG誘導時，29KD處有蛋白表達，與理論相符，IPTG濃度對目的蛋白表達量影響不大。30℃誘導時目的蛋白大部分以包涵體的形式存在，只有少部分以可溶形式存在；25℃過夜誘導不能明顯增加目的蛋白的可溶性表達量；25℃添加體積分數(shù)為5%乙醇誘導，目的蛋白的可溶形式表達量明顯增加。見圖1、圖2、圖3。

2.2 TRAIL蛋白生物活性檢測

MTT結(jié)果顯示純化的目的蛋白能夠誘導Jurkat細胞凋亡，具有良好的生物活性。見圖4。

圖1 30℃不加乙醇誘導融合蛋白表達分析

圖2 25℃未加乙醇誘導融合蛋白表達

圖3 25℃加乙醇誘導融合蛋白表達

圖4 MTT實驗結(jié)果分析

3 討論

TRAIL可以誘導許多腫瘤細胞發(fā)生凋亡，而對大多數(shù)正常細胞沒有明顯毒性，比TNF－α和Fas－L具有更廣的抗癌譜，而且不會像TNF－α和Fas－L那樣產(chǎn)生嚴重的炎癥反應［7］。因此，TRAIL在今后治療人類惡性腫瘤方面具有很廣泛的應用前景，TRAIL及其受體的研究也將為腫瘤治療藥物的開發(fā)開辟新的路徑。

以往克隆目的基因的常用方法是通過提取細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得，隨著基因合成技術(shù)進步，直接優(yōu)化密碼子合成基因已成為一種新的選擇。我們利用基因合成的方法直接合成了TRAIL的胞外段，節(jié)省了時間，表達效果也不錯，成本與常規(guī)方法的相差不大。

TRAIL全長281bp，相對分子量32.5kDa，等電點為7.63，為典型的Ⅱ型跨膜蛋白，C段114～281氨基酸殘基形成一個同源三聚體結(jié)構(gòu)，參與特異性受體結(jié)合。TRAIL第114～281位氨基酸堿基為胞外片段［4］，我們實驗表達的該片段具有誘導Jurkat細胞凋亡的活性。

為獲得更高比例的可溶性目的蛋白，我們參照唐蓓和楊芳等人發(fā)表的文獻，進一步探索多種優(yōu)化表達方法，最終以加入誘導劑同時加入體積分數(shù)為5%乙醇的方法獲得滿意的結(jié)果，MTT法檢測證明目的蛋白具有生物活性。我們的這次實驗與以往實驗相比省去包涵體復性的過程，直接獲取活性蛋白，減少了工作量，同時也為今后原核表達其他可溶性活性蛋白誘導條件的選擇提供了參考。

［1］Gura T.How TRAIL kills cancer cells，but not normal cells［J］.Science，1997，277（5327）：768.

［2］Griffith T S，Lynch D H.TRAIL：Amolecule with multiple receptors and control mechanisms［J］.Curr Opin Immunol，1998，10（5）：559－563.

［3］Ashkenazi A，Dixit V M.Apoptosis control by death and decoy receptors［J］.Curr Opin Cell Biol，1999，11（2）：255－260.

［4］朱梅，王祥喜，李雪梅，等.TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制及其在腫瘤生物治療中的應用前景［J］.生物物理學報，2012，28（6）：448－456.

［5］唐蓓，何鳳田，蔡紹皙.人TRAIL分子胞外區(qū)的純化及活性檢測［J］.中國免疫學雜志，2003，19（8）：554－557.

［6］楊芳，劉紅巖，徐維明.sTRAIL基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達［J］.藥物生物技術(shù)，2003，10（3）：129－132.

［7］Shirley S，Morizot1A ，Micheau O.Regulating TRAIL receptor－induced cell death at the membrane：a deadly discussion［J］.Recent Patents Anticancer Drug Discovery，2011，6（3）：311－323.

［責任編輯 姬 荷］

Expression the tracellular domain of human TRAIL and identification of its activity

BAO Yinghuan，CHENG Xiangshu，LIU Fengtao＊（Key Laboratory of Celluar andmolecular Immunology，Institution of immunology，Medical School of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China）

ObjectiveTo obtain the extracellular domain of tumor necrosis factor－related apoptosis－inducing ligand（TRAIL）with activity.MethodsWe designed and synthesized DNA encoding the TRAIL extracellular DNA sequences according to the coding preference of the E.coli and constructed the prokaryotic expression vector：the pET30aTRAIL fusion expression plasmid.The recombinant plasmid was transformed into the expression host E.coli BL21to induce expression under different temperature conditions，different concentrations of IPTG and alcohol.After inducing expression we used the SDS－PAGE method to analysis of expression product and used the MTT method to assay the activity of expression product.ResultsThe constructed engineering bacteria expressed a 29KD soluble TRAIL fusion protein，and this protein can induce Jurkat cell apoptosis.ConclusionWe successful express the extracellular domain of human TRAIL protein with activities.

TRAIL；Prokaryotic expression；Jurkat cells；Apoptosis；apoptosis

Q782

A

1672－7606（2014）02－0117－03

2014－02－12

河南省醫(yī)學科技攻關計劃項目資助（WKJ2007－021）。

鮑應環(huán)（1987－），女，河南信陽人，碩士研究生，從事抗體工程研究。

＊通訊作者：劉峰濤（1970－），男，河南 開封 人，博士，副教授，從事分子免疫的教學與科研工作。