超聲法提取欒樹干花中總黃酮的正交實驗

袁 琦，蒲曉輝，陳毛芬，陳 鑫，李 哲，竟香艷，周云豐，崔麗麗

（河南大學 藥學院，河南 開封 475004）

超聲法提取欒樹干花中總黃酮的正交實驗

袁 琦，蒲曉輝＊，陳毛芬，陳 鑫，李 哲，竟香艷，周云豐，崔麗麗

（河南大學 藥學院，河南 開封 475004）

目的對超聲提取法提取欒樹干花中總黃酮的工藝進行優(yōu)化。方法利用超聲法提取欒樹干花中的總黃酮，考察乙醇濃度、料液比、超聲時間3個因素對總黃酮得率的影響，通過單因素和正交試驗確定了提取的最佳工藝條件。結果最佳提取工藝條件為體積分數(shù)70%乙醇、料液比1∶30、超聲時間90min。結論工藝重現(xiàn)性好，對進一步的研究開發(fā)有比較好的參考價值。

欒樹干花；總黃酮；正交實驗；超聲提取

無患子科植物欒樹，俗稱黑葉樹、木欄牙（河南）［1］?！渡褶r本草經》記載，欒樹干燥的干花，又名欒華，味苦，性寒，無毒，歸肝經。欒樹干花藥理作用的發(fā)揮與其所含的化學成分密不可分。研究［2］發(fā)現(xiàn)，其化學成分主要含：胡蘿卜苷（I）、木犀草素（IV）、黃酮類化合物等。具有清肝明目、消腫止痛的功效。主要用于治療目赤腫痛、多淚、眼角潰爛。多與黃連合用，清熱解毒，以達到消除目赤火熱的功效。有關欒樹干花中總黃酮提取方法的研究較少［3］。為更有效的開發(fā)和利用藥材資源，充分提取欒樹干花中所含的總黃酮成分，遂采用正交設計的方法進行了提取工藝的研究，以期為進一步的開發(fā)利用提供參考。

1 儀器試劑與樣品

1.1 儀器試劑

紫外可見分光光度計UV－1600（北京瑞麗有限公司）；AS3120超聲波清洗器（天津奧特塞恩儀器有限公司）；SHB－III循環(huán)水式真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；蘆?。ㄖ袊幤飞镏破窓z定所）；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 樣品

欒樹干花（采于河南大學金明校區(qū)），自然風干，粉碎，裝袋備用。

2 超聲法提取欒樹干花中總黃酮的測定方法

2.1 顯色試劑以及測定波長的選擇

本法選用NaNO2－Al（NO3）3－NaOH作為顯色劑［4］，此法顯色后溶液澄清，吸光讀數(shù)穩(wěn)定，故用50g／L－ NaNO2－ 100g／L － Al（NO3）3－40g／LNaOH作為顯色體系。對2份樣品和蘆丁對照品顯色后，在250～600nm的范圍內紫外掃描確定吸收光譜，蘆丁對照品λmax＝510nm處，樣品提取液的λmax＝507～510nm，故選擇在50g／LNaNO2－100g／L－Al（NO3）3－40g／LNaOH 顯色后在510nm處測定吸光度。

2.2 欒樹干花總黃酮的超聲波提取及含量測定

將干燥的欒樹干花粉碎，稱取1.0g欒樹花干粉于錐形瓶中，分別在不同的超聲時間、料液比、乙醇濃度的條件下進行提?。怀闉V，將提取液過濾、定容于50mL容量瓶中，即得供試品溶液。精密量取1mL供試品溶液于10mL容量瓶中，同“2.1”所述操作，并根據(jù)線性回歸方程計算欒樹干花總黃酮得率。

2.3 標準工作曲線的繪制

精密稱取0.01051g蘆丁對照品，置于50mL容量瓶中，加入體積分數(shù)為70%乙醇定容，搖勻即得標準液。精密量取已制備的對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL，分別置于10mL容量瓶中，各加入50g／L亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min；加入100g／L硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min；加入40g／L氫氧化鈉溶液4mL，再用體積分數(shù)為30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，以相應的試劑溶液作參比，于510nm處測定吸光度。（如圖1）以吸光度A為縱坐標，蘆丁濃度C為橫坐標，得回歸方程為Y ＝0.1159 x－0.0091（R2＝0.9993），蘆丁在濃度0.01051～0.07357g／L范圍有較好的線性。

圖1 蘆丁標準溶液濃度

2.4 精密度實驗

精密吸取蘆丁標準品溶液5mL置10mL容量瓶中，加體積分數(shù)為30%乙醇定容至刻度，再從中吸取3mL置另一10mL容量瓶中，加50g／L NaNO2溶液0.3mL搖勻，放置6min；加100g／LAl（NO3）3溶液0.3mL，搖勻，放置6min；加40g／L NaOH溶液4mL，再用體積分數(shù)為30%乙醇液稀釋至刻度，搖勻。在510nm處重復測定5次，得吸光度平均值為0.364，RSD 為0.19%。

2.5 重復性實驗

分別精密稱取欒樹干花5份，置于錐形瓶中超聲30min后，抽濾，定容于50mL容量瓶中，再從待測液中抽取1mL于10mL容量瓶中，按“2.1”項下操作，搖勻后在510nm處測其吸光度，得黃酮含量的平均值為1.760，RSD 為0.82%。

表1 精密度實驗結果

表2 重復性實驗結果

2.6 欒樹干花加樣回收率實驗

精取欒樹干花粉末0.5g，共3份，分別加入高、中、低不同濃度的蘆丁對照品，置于錐形瓶中，加入體積分數(shù)70%乙醇30mL，用超聲波震蕩萃取黃酮30min，抽濾，定容到50mL容量瓶中，加入50g／L亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min；加入100g／L硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min；加入40g／L氫氧化鈉溶液4mL，再用體積分數(shù)為30%乙醇稀釋至刻度，搖勻后在510nm處測其吸光度，每個濃度重復測定3次，得出蘆丁的回收率及相對標準偏差（表3）。

表3 回收率實驗結果

3 欒樹干花中總黃酮測定的正交實驗

3.1 單因素實驗

選取超聲時間、料液比和乙醇濃度3個可能影響提取效果的因素做單因素實驗，以總黃酮得率為考察指標來確定各因素的合適范圍。考察某一因素對欒樹干花總黃酮得率的影響時，固定其他因素及水平。

3.1.1 超聲時間對總黃酮提取量的影響

控制其他因素不變，從表4可以看出，隨著超聲時間的延長總黃酮的提取量先上升后下降，在60min時總黃酮的提取量值最高，隨后再增加溶劑用量其提取量反而減小?？紤]到時間太短不足以使欒樹干花中總黃酮類物質完全析出，時間若過久則又會使提取出的總黃酮類物質分解。因此，超聲時間選取60min左右為宜。

表4 超聲時間

3.1.2 料液比對總黃酮提取量的影響

控制其他因素不變，一般來說，溶劑用量越大對黃酮類物質的溶解能力越強，越有利于黃酮類物質的擴散，提取效果越好。實驗得知，總黃酮提取量開始時隨著料液比的增大而增大，料液比在1∶30時總黃酮的提取量值最高，隨后再增加溶劑用量其提取量反而減小。因此，料液比選取1∶30左右為宜（結果見表5）。

表5 料液比

3.1.3 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

控制其他因素不變，考察乙醇濃度對欒樹干花總黃酮提取量的影響，（結果見表6）。由表6可知欒樹干花總黃酮的提取量開始隨著乙醇濃度的升高，在乙醇濃度達到體積分數(shù)60%時，總黃酮的提取量到最大值，之后隨著乙醇濃度的增加其提取量又逐漸變低，主要原因是乙醇濃度不同，極性也不同，體積分數(shù)為60%的乙醇極性與黃酮類物質的極性相似［5］，隨著乙醇濃度的升高，一些脂溶性物質的溶出增加，影響了黃酮類物質的浸出。

表6 乙醇濃度

3.2 正交實驗

在單因素試驗的基礎上，確定超聲時間、料液比和乙醇濃度3個因素進行正交試驗以總黃酮得率為考察指標來確定提取欒樹干花總黃酮的最佳工藝條件。

表7 因素水平設計

表8 L9（33）正交實驗設計及結果

表9 方差分析表（%）

正交實驗結果表明，超聲時間對欒樹干花總黃酮的提取效果有顯著的影響。醇濃度對總黃酮提取的影響較小，料液比對欒樹干花總黃酮的提取效果幾乎無影響［6］。由表8、表9可知，3個因素對總黃酮得率的影響大小依次為：超聲時間A＞醇濃度C＞物料比B，提取欒樹干花總黃酮的最佳工藝條件為A3B2C3即 濃度70%乙醇，料液比1∶30，超聲時間90min。

3.3 最佳工藝驗證實驗

為進一步考察最佳工藝的穩(wěn)定性和合理性，按優(yōu)化的最佳工藝條件進行重復性試驗3次，分別測定欒樹干花總黃酮的含量，得出平均總黃酮含量以及相對標準偏差值。

表10 最佳工藝的驗證實驗（%）

4 結論與討論

超聲提取是一種提取效率較高的提取技術，超聲提取欒樹干花中的總黃酮。單因素考察了超聲時間、料液比、乙醇濃度對總黃酮提取量的影響［6］，在此基礎上進行正交實驗，結果表明超聲時間對提取率的影響最大。

最佳提取工藝如下，乙醇濃度70%，料液比1∶30，超聲時90min。在此條件下，做3次平行實驗，欒樹干花總黃酮的平均提取率為1.955%。該方法省時，溶劑用量少，提取率高，且設備簡單、操作簡單方便，重現(xiàn)性好，對進一步工藝開發(fā)有較好的參考價值。

［1］楊小鳳，付宏征，雷海民，等.欒樹的化學成分［J］.藥學學報，1999，34（6）：1716－1719.

［2］中國科學院植物研究所.中國植物志［M］.北京：科學出版社，1985：54.

［3］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草［M］.上海：上海科學技術出版社，1999：554－558.

［4］李蓉，李小平，于生蘭，等.超聲法提取蜘蛛香中總黃酮的正交試驗研究［J］.安徽農業(yè)科學，2008，36（25）：10943－10977.

［5］趙其國，黃國勤，黃海燕.鄱陽湖生態(tài)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展［J］.土壤學報，2007，44（2）：318－326.

［6］馮海燕，李向軍，胡瑞省，等.超聲法提取萹蓄總黃酮的正交實驗研究［J］.河北科技大學學報，2011，32（6）：611－614.

［責任編輯 李武營］

Orthogonal test in extraction of total flavone from dried flowers of koelreuteria paniculata by ultrasonic method

YUAN Qi，PU Xiaohui＊，CHEN Maofen，CHEN Xin，LI Zhe，JING Xiangyan，ZHOU Yunfeng，CUI Lili（Pharmacy College，Henan Uuniversity，Kaifeng，Henan 475004，China）

ObjectiveThe research aimed to optimize the extraction technology of total flavone from dried flowers of koelreuteria paniculata by ultrasonic method.MethodsTotal flavone was extracted from dried flowers of koelreuteria paniculata by ultrasonic method.Teffects of three factors including ethanol concentration，soli dliquid ratio，ultrason time on the yield of total flavone were investigated.The optimum technological conditions of total flavone exaction were confirmed through single factor test and orthogonal test.ResultsThe optimum exaction technological conditions were as follows：70%ethanol，solid－liquid ratio of 1：30and ultrasonic time of 90min.ConclusionThis technology has good reproducibility and has better reference value for further technology development of total flavone.

dried flowers of koelreuteria paniculata；Total flavone；Orthogonal test；Ultrasonic extraction

R927.11

A

1672－7606（2014）02－0104－04

2013－12－26

河南大學2012年度大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目（12NB0261）。

袁琦（1974－），女，河南 開封 人，碩士生導師，副教授，從事藥物分析的教學及科研工作。