TFPI-2與消化道惡性腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展*

王鳳記 王慶寶

(山東省寄生蟲病防治研究所，山東 濟(jì)寧 272033)

組織因子途徑抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)也稱胎盤蛋白-5，又稱為基質(zhì)相關(guān)性絲氨酸蛋白酶抑制劑，它是絲氨酸蛋白酶抑制物超家族成員之一，含有kunitz型結(jié)構(gòu)域，是一種蛋白酶抑制劑。最初由Jandial和Horne在雙胞胎妊娠者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)這種蛋白，對(duì)其進(jìn)行研究并命名為胎盤蛋白-5。研究發(fā)現(xiàn)，胎盤蛋白-5氨基酸順序與人組織因子途徑抑制物高度同源，且兩者性質(zhì)相似，又將其命名為組織因子途徑抑制物-2。人類的TFPI-2蛋白質(zhì)序列最初由Spercher研究后公布，但TFPI-2的立體結(jié)構(gòu)仍不清楚，還需進(jìn)一步的研究?，F(xiàn)就近年來關(guān)于TFPI-2與消化道惡性腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展分述如下。

1 TFPI-2的分子結(jié)構(gòu)

成熟TFPI-2分子有213個(gè)氨基酸組成，由5個(gè)部分構(gòu)成，含有一個(gè)富含堿性氨基酸的C端和一個(gè)富含酸性氨基酸的N端，還包括3個(gè)相連的Kunitz結(jié)構(gòu)域[1]，并且每個(gè)結(jié)構(gòu)域中含有3對(duì)二硫鍵。其中，第1個(gè)結(jié)構(gòu)域與TFPI-1的同源性高達(dá)45%。但第3個(gè)結(jié)構(gòu)域與TFPI-1相似性最高，為53% ；還知第2結(jié)構(gòu)域的同源性為35%。TFPI-2對(duì)蛋白水解酶的抑制作用通過Kunitz結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)的，主要是由于第1個(gè)結(jié)構(gòu)域能與Pl殘端與蛋白水解酶的蛋白袋結(jié)構(gòu)結(jié)合。第1個(gè)結(jié)構(gòu)域的三維立體結(jié)構(gòu)呈Kuntiz蛋白酶抑制劑折疊結(jié)構(gòu)，它含有Arg20到Phe33雙帶β-sheet，也包括Trp48到Ala54的α-螺旋結(jié)構(gòu)。核心區(qū)域具有高度的保守性，由3對(duì)二硫鍵與一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。在Leu19至Tyr33的結(jié)合環(huán)中，第1個(gè)結(jié)構(gòu)域與纖維蛋白酶的活性位點(diǎn)有關(guān)。第1個(gè)結(jié)構(gòu)域，在接近纖維蛋白酶活性位點(diǎn)的P1殘基最重要。由于第1個(gè)結(jié)構(gòu)域纖維蛋白酶復(fù)合物多了2個(gè)氫鍵，因此兩者更加牢固的結(jié)合。由于TPFI-2與惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，這一點(diǎn)將有助于為臨床尋找抑制腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的藥物。

2 TFPI-2在人體內(nèi)的分布及含量

人類的多種細(xì)胞表達(dá)并分泌TFPI-2，已知上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞含有TFPI-2。還發(fā)現(xiàn)人體包皮內(nèi)的成纖維膠原、新生角質(zhì)化細(xì)胞生成TFPI-2，臍靜脈、新生表皮微血管的內(nèi)皮細(xì)胞也有表達(dá)。在健康人體循環(huán)血液中TPFI-2含量非常低，健康男性血液中為0.19～0.75μɡ/L，均值是0.43μɡ/L；非妊娠女性血液中為0.20～0.90μɡ/L，均值為0.49μɡ/L，其含量與月經(jīng)周期無關(guān)。妊娠女性體內(nèi)，血液中TFPI-2含量明顯升高。在精漿及卵泡液中，也含有少量的TFPI-2。在精漿中，TFPI-2與精子的活性有關(guān)；在卵泡液中，TFPI-2參與與卵泡的破裂過程。另外發(fā)現(xiàn)，肝素顯著影響血液中TPFI-2的含量，使用小劑量肝素后，血液中hTFPI-2升高10～40倍，這說明TFPI-2可能與內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生結(jié)合，當(dāng)注入肝素時(shí)，TFPI-2大量釋放入血[2]。研究還發(fā)現(xiàn)，肝素、硫酸軟骨素與精氨酸相互作用影響TFPI-2的定位，已知70～75% TFPI-2與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，25～30% TFPI-2與細(xì)胞相結(jié)合，在條件培養(yǎng)基中，TFPI-2含量?jī)H僅0～2%。

3 TFPI-2基因與表達(dá)

人類的TFPI-2基因位于7q22，長(zhǎng)約7Kb，包括5′非編碼區(qū)、3′非編碼區(qū)，還含有結(jié)構(gòu)基因。有的在5′非編碼區(qū)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)順式作用元件，它們調(diào)控基因表達(dá)。在-312bp到-81bp處，還發(fā)現(xiàn)2個(gè)SP1和3個(gè)AP1潛在結(jié)合位點(diǎn)，AP1上調(diào)某些細(xì)胞TFPI-2的表達(dá)，在不同的腫瘤細(xì)胞中，SP1調(diào)控TFPI-2表達(dá)量。在人類許多惡性腫瘤細(xì)胞中，常常發(fā)現(xiàn)編碼TFPI-2基因的缺失。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)TFPI-2基因表達(dá)沉默同時(shí)伴有啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TFPI-2基因的CpG島含有核心啟動(dòng)子，位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近，CpG島由富含CpG雙核甘酸序列構(gòu)成，出現(xiàn)CG雙核苷酸數(shù)目大于60%。在幾乎所有類型的內(nèi)皮細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)有TFPI-2表達(dá)，在皮膚毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中，TFPI-2表達(dá)量最高；凝血酶上調(diào)TFPI-2的表達(dá)，TNF-α、PMA、內(nèi)毒素等炎癥因子也有相似的作用。另外，在許多高度惡性的腫瘤細(xì)胞中，TFPI-2的表達(dá)量很低；而在惡性程度低的腫瘤細(xì)胞中，TFPI-2表達(dá)量往往較高。另有研究發(fā)現(xiàn)，通過MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，多種誘導(dǎo)因子調(diào)節(jié)TFPI-2的表達(dá)的。

4 TFPI-2與消化道惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系研究進(jìn)展

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜過程，一般經(jīng)過癌前期、原位癌及浸潤(rùn)癌三個(gè)階段，經(jīng)過多步驟完成，由多種基因參與的過程。根據(jù)Hanahan和Weinberg的理論，正常細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，必須獲得下面六種能力：①細(xì)胞無限生長(zhǎng)的能力；②細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)自給能力；③細(xì)胞對(duì)外界生長(zhǎng)信號(hào)的調(diào)控不敏感；④細(xì)胞逃避誘導(dǎo)凋亡的能力；⑤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的能力；⑥持續(xù)的血管生成能力。

4.1TFPI-2抑制腫瘤的侵襲﹑轉(zhuǎn)移 惡性腫瘤發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移時(shí)，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜。腫瘤細(xì)胞分泌多種絲氨酸蛋白酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，成為腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移關(guān)鍵點(diǎn)。TFPI-2作為一種廣譜的絲氨酸蛋白酶抑制物，TFPI-2抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，總結(jié)如下：1)TFPI-2能夠抑制腫瘤新生血管形成，作用機(jī)制包括：①TFPI-2抑制金屬蛋白酶及纖溶物的活性；②TFPI-2對(duì)血管生成因子的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。在惡性腦膜瘤、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、纖維肉瘤等研究中，TFPI-2能夠抑制新生血管的形成，因此TFPI-2能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[3]。2)TFPI-2誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，研究發(fā)現(xiàn)，TFPI-2能夠抑制細(xì)胞增殖，TFPI-2還能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與細(xì)胞凋亡受體結(jié)合，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。在發(fā)生腫瘤細(xì)胞凋亡時(shí)，發(fā)現(xiàn)凋亡蛋白BAX高表達(dá)，同時(shí)XIAP、抗凋亡蛋白Bcl-2低表達(dá)，發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)[4,5,6]。3)TFPI-2能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，由多種蛋白聚糖構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)，在細(xì)胞生長(zhǎng)分化中，在細(xì)胞發(fā)生黏附遷移時(shí)均起重要作用；并且其內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，需要生長(zhǎng)因子、蛋白水解酶及其抑制劑間的動(dòng)態(tài)平衡。TFPI-2與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑結(jié)構(gòu)相似，通過多價(jià)螯和作用，氨基末端自由氨基上Zn+活化位點(diǎn)可與MMPs及proMMP-2發(fā)生結(jié)合，抑制絲氨酸蛋白酶及基質(zhì)金屬蛋白酶與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，降低對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用?？梢奣FPI-2能夠抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，在腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移時(shí)，發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[7]。4)在TF-FⅦα復(fù)合物的形成中，TFPI-2起抑制作用。腫瘤組織表達(dá)組織因子，組織因子與FⅦα結(jié)合，形成TF-FⅦα復(fù)合物，使腫瘤患者呈高凝狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力增加。組織因子途徑抑制劑對(duì)這種效應(yīng)有抑制作用，在TF-FⅦα復(fù)合物介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，TFPI-2發(fā)揮重要作用，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。5)TFPI-2能夠抑制細(xì)胞外周蛋白，TFPI-2結(jié)合補(bǔ)體gC1qR，調(diào)節(jié)蛋白酶、激肽原的活性，在腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移時(shí)發(fā)揮重要作用[8]。關(guān)于TFPI-2的其他生物學(xué)作用，總結(jié)以下：①TFPI-2參與纖維蛋白溶解調(diào)控，TFPI-2能夠調(diào)控多種絲氨酸蛋白酶，參與纖溶與凝聚過程。纖溶酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶的活性能夠被重組TFPI-2抑制，重組TFPI-2也抑制血漿激肽釋放酶和XIa凝血因子的活性。②TFPI-2能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，成纖維細(xì)胞、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞合成并分泌TFPI-2。Choi等[9]用野生型R24Q∕KD1和KD1突變體處理芥子氣類似物損傷的皮膚，發(fā)現(xiàn)給予這兩種蛋白后，傷口愈合明顯加快，wt-KD1作用更為明顯。Shibuya等[10]利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞用TFPI-2處理，前后對(duì)比研究蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TFPI-2可上調(diào)MDM2、C-myc和轉(zhuǎn)錄因子E2F3的表達(dá)，通過調(diào)控Rb∕E2F、p53 及有絲分裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，TFPI-2促進(jìn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖。③TFPI-2保護(hù)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。已知血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TFPI-2，在動(dòng)脈粥樣硬化組織中，也發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞表達(dá)TFPI-2，TFPI-2的表達(dá)與基質(zhì)金屬蛋白酶水平有關(guān)，在斑塊破裂和基質(zhì)降解區(qū)TFPI-2含量很低；在動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化時(shí)，TFPI-2與VIIa凝血因子復(fù)合物結(jié)合，TFPI-2滅活VIIa凝血因子復(fù)合物，降低凝血酶生成，直接抑制纖溶酶，間接抑制MMP，阻斷MMP降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用[11,12]。

4.2TFPI-2促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移 研究發(fā)現(xiàn)TFPI-2對(duì)原癌基因c-fos，癌基因c-myc、mdm-2有誘導(dǎo)作用，TFPI-2影響視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白的表達(dá)。TFPI-2在血管平滑肌細(xì)胞中，TFPI-2有絲裂原的作用，平滑肌細(xì)胞中DNA合成增加，TFPI-2激活絲裂原蛋白激酶，TFPI-2使平滑肌細(xì)胞中原癌基因c-fos的表達(dá)，TFPI-2對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白的表達(dá)也有一定的調(diào)節(jié)作用。c-myc影響腫瘤細(xì)胞增殖分化，mdm-2對(duì)抑癌基因p53負(fù)性調(diào)節(jié)作用，它們的表達(dá)影響腫瘤的發(fā)生[13,14]。

4.3TFPI-2與消化道惡性腫瘤 TFPI-2是一種糖蛋白，由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌，是外源性凝血途徑的特異性抑制劑，是人體內(nèi)重要的生理性抗凝物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)TFPI-2在發(fā)揮抗凝作用的同時(shí), 還在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中有重要作用，對(duì)傷口愈合、新生血管生成及動(dòng)脈粥樣硬化也有一定的作用。在腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移時(shí)，TFPI-2發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在消化道惡性腫瘤中，其研究進(jìn)展如下。

4.3.1TFPI-2與胰腺癌 胰腺癌是惡性程度很高的腫瘤之一，是發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤。死亡率在因癌死亡病例的第4位，胰腺癌發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)。因早期診斷較困難，解剖部位復(fù)雜，手術(shù)切除率低，術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。Sato等[15]通過微陣列技術(shù)研究，發(fā)現(xiàn)在正常胰腺組織中，TFPI-2高表達(dá)， 在高侵襲性胰腺癌細(xì)胞株中，TFPI-2未表達(dá)。在TFPI-2表達(dá)缺失的胰腺癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生甲基化，用佛波醇酯處理后，部分甲基化的胰腺癌細(xì)胞株TFPI-2的表達(dá)增加。在體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，使TFPI-2的表達(dá)恢復(fù)，胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯緩慢，胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯下降。有人在胰腺癌患者胰液標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)甲基化的TFPI-2基因；而在胰腺良性病變胰液標(biāo)本中，未檢測(cè)到甲基化的TFPI-2基因，與Jiang等[16]的報(bào)道一致。湯志剛也報(bào)告[17]，TFPI-2的表達(dá)與胰腺癌組織學(xué)分級(jí)及其臨床分期有關(guān)，中、低分化的胰腺癌組織中TFPI-2陽性表達(dá)率低于高分化的胰腺癌組織，Ⅲ、Ⅳ期的胰腺癌組織TFPI-2的表達(dá)亦低于Ⅰ、Ⅱ期胰腺癌組織。因此，TFPI-2基因有望對(duì)胰腺癌診斷提供非常重要的科學(xué)依據(jù)，將來對(duì)胰腺癌的分子靶向治療發(fā)揮著重要作用。

4.3.2TFPI-2與肝癌 原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率有增高的趨勢(shì)，死亡率占腫瘤死亡率的第2位。因惡性程度高，患者早期發(fā)生浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，手術(shù)易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差。Neaud等發(fā)現(xiàn)在人類肝臟中的成肌纖維細(xì)胞，能夠合成分泌TFPI-2，TFPI-2增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲能力，通過肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子介導(dǎo)HGF/尿激酶/纖維蛋白溶酶途徑，TFPI-2促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲。Wong等[18]研究中，用去甲基化藥物5-Aza-dC處理原發(fā)性肝癌細(xì)胞株，可以恢復(fù)TFPI-2表達(dá)。

4.3.2TFPI-2與胃癌及結(jié)直腸癌 胃癌是我國(guó)主要的消化道惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)我國(guó)是胃癌死亡率較高的地區(qū)之一。近年來，在世界范圍內(nèi)胃癌的發(fā)病率有逐漸下降的趨勢(shì)，而在我國(guó)除局部地區(qū)外，還未發(fā)現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，我國(guó)胃癌的發(fā)病率及死亡率均明顯高于世界平均水平。因胃癌早期診斷率低，術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后也很差。有人采用免疫組織化學(xué)方法，研究胃癌、結(jié)直腸癌中TFPI-2的表達(dá)， 發(fā)現(xiàn)顯低于正常黏膜組織，并且隨著腫瘤惡性程度增加，TFPI-2的表達(dá)逐漸降低。在胃癌組織中，浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞增加TNF-α及內(nèi)毒素分泌，上調(diào)TFPI-2的表達(dá)，保持細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移起著重要的調(diào)節(jié)作用[19]。Hisashi Takada等[20]也通過免疫組織化學(xué)與RT-PCR方法，進(jìn)一步證實(shí)了胃癌中TFPI-2的轉(zhuǎn)錄失活與啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常甲基化有關(guān)。

4.3.4TFPI-2與食管癌 食管癌是人類較常見的消化道惡性腫瘤之一，我國(guó)是食管癌高發(fā)國(guó)家之一，死亡率僅次于胃癌。在大多數(shù)食管癌細(xì)胞株中，TFPI-2表達(dá)缺失，研究發(fā)現(xiàn)TFPI-2表達(dá)缺失與CpG島的甲基化有關(guān)，用乙酰唑胺與縮酚酸肽處理食管癌細(xì)胞株，解除CpG島的甲基化，TFPI-2的表達(dá)增加。因此TFPI-2表達(dá)水平對(duì)判斷食管癌的預(yù)后可能提供有益的幫助，并且對(duì)食管癌的治療提供新的途徑。

5 存在的問題與展望

TFPI-2作為絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員之一，參與消化道惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，成為近年來分子生物學(xué)研究的新熱點(diǎn)。在消化道惡性腫瘤的研究中，對(duì)于TFPI-2的研究已經(jīng)取得明顯的進(jìn)展，仍需進(jìn)行深入的研究。TFPI-2對(duì)多種消化道惡性腫瘤有抑制效應(yīng)，也能增加一些腫瘤的侵襲性？在消化道惡性腫瘤細(xì)胞中，TFPI-2是如何發(fā)生甲基化的？TFPI-2的結(jié)構(gòu)、亞型詳細(xì)情況，TFPI-2是如何分解的？對(duì)于惡性程度較高的消化道腫瘤，可否尋到治療的靶基因？隨著人們對(duì)TFPI-2的深入研究，在消化道惡性腫瘤的臨床診斷﹑治療及預(yù)防中，TFPI-2可能有美好的前景。

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