膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子與帕金森病的相關性研究進展

于麗麗, 田德薔, 陳曉紅, 趙志剛, 王慧媛

(1. 北京郵電大學醫(yī)院 藥劑科, 北京, 100876; 2. 首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院 藥劑科, 北京, 100050)

PD是一種不能治愈的使人衰弱的神經退行性疾病[1], 臨床表現(xiàn)為一組特殊的運動障礙癥狀(馬達啟動癥狀最常見，包括彎曲膝蓋、踮腳尖步態(tài)、僵直腿輕偏癱步態(tài)、Hoover′s 征麻痹或運動遲緩征)、快感缺乏(占15%)、手-眼協(xié)調受損等癥狀[2-5]。隨著年齡和時間的增長，男性PD患者逐漸增多[6]。有研究[7]發(fā)現(xiàn)該病死亡率是每年0.25/十萬居民，且大多為年齡>80歲的男性。GDNF是神經細胞生存和維持表型所必需的一種蛋白質，對PD有神經保護作用的一種潛在DA能保護因子。試驗性的研究已經證實在與PD發(fā)病機制相關的異常凋亡和炎性機制中，GDNF參與DA合成、代謝酶缺失、線粒體功能紊亂、氧化應激和基因毒素反應。GDNF保護含兒茶酚胺的細胞不受毒性侵害，是有潛能的治療PD療法且正在進行的臨床試驗中是有效的[8-9]。

1 GDNF 家族配體、受體表達和信號傳遞

1.1 神經秩蛋白(NRTN)

GDNF配體家族目前包括4種營養(yǎng)因子: GDNF、Neurturin( NRTN)、Persephin(PSPN)及ARTNemin(ARTN)。NRTN可支持外周和中樞神經系統(tǒng)生長、維護和分化，目前正在進行對PD疾病的一系列臨床研究。許多GDNF細胞發(fā)揮作用都是由綁定到GDNF家族的受體α1(GFRα1)啟動，由多種細胞內信號通路介導，尤其大多數(shù)通過Ret酪氨酸激酶介導。GFRα1在紋狀體中表達，是黑質多巴胺能投射的目標。Nikolai等[10]研究在成人紋狀體(Str)突觸后表達的GFRα1對DA神經元的發(fā)育有深遠影響，導致成人DA神經元數(shù)量增加40%。信號轉導與轉錄激活因子(STAT3)以前表明是被致癌基因RET激活，而不受配體和GFRα支配。Lihan等[11]研究證實NRTN誘導初級神經元和神經細胞中STAT3的絲氨酸727而不是酪氨酸705的磷酸化。值得注意的是STAT3磷酸化被發(fā)現(xiàn)是由特殊的媒介GFRα2c和RET9亞型所介導，此外STAT3的絲氨酸顯性負性突變體破壞了NRTN誘導的神經突生長，說明了STAT3作為NRTN發(fā)揮功能的一種下游媒介。這些發(fā)現(xiàn)證實了特殊的GFRα2c和RET9亞型在介導NRTN激活STAT3, 以及在通過線粒體內部P-Ser-STAT3介導NRTN誘導神經突生長中還有未被認知的新作用。

1.2 蛋白分選受體(SorLA)

GDNF捆綁到它的受體GFRa1和信號，通過跨膜受體酪氨酸激酶RET或RET獨立通過神經細胞黏附分子(NCAM)或多配體聚糖-3，但細胞與GDNF和它的受體間的相互作用仍然不清楚。Simon等[12]發(fā)現(xiàn)，SorLA作為GDNF/GFRa1復合體的排序受體，指引這個復合體從細胞表面到核內。憑借這個機制，在GFRa1再循環(huán)并建立一個高效的GDNF的清晰通路中，GDNF靶向作用到溶酶體和下級目標。SorLA/GFRa1復合體由于胞吞作用(但不是降解作用)進一步靶向RET，影響GDNF誘導的神經營養(yǎng)活動。SorLA缺陷小鼠顯示了較高的GDNF水平，多巴胺能的功能顯著改善、明顯極度活躍和焦慮減少，所有這些表現(xiàn)都與異常的GDNF作用有關?？傊@些發(fā)現(xiàn)[12-13]確立了SorLA作為一個在中樞神經系統(tǒng)(CNS)中使GDNF起作用的關鍵調節(jié)器。

1.3 核受體相關因子(nurr)

目前在GDNF與其相關神經元進行PD患者神經保護的臨床試驗中，盡管經典神經毒動物模型對于PD有效，但GDNF還沒能擔負起DA神經元被突觸核蛋白(SYN)毒性殺死的PD嚙齒模型的保護作用。Mickael等[14]使用SYN介導的PD大鼠模型，顯示過量細胞濃度的SYN有效地阻止了DA神經元對GDNF的營養(yǎng)應答，證明GDNF信號阻滯是由于減少轉錄因子Nurr1和其下游靶目標(GDNF受體Ret)的表達。缺失Nurr1導致Ret表達減少，并伴隨DA神經元對于外生GDNF的應用反應完全失效。然而當研究者誘導Nurr1的表達后，Ret受體被恢復成多巴胺神經元遭受SYN毒性時對GDNF一樣的反應。結果[14-15]證實Nurr1是在細胞中抵御SYN毒性的關鍵因素，并強調指出Nurr1可以作為一個有前景的PD神經保護療法的新靶標。

1.4 泛素蛋白酶(UPS)系統(tǒng)

UPS系統(tǒng)的損傷是PD患者神經變性過程潛在的細胞機制，Yunlan等[16]研究顯示，在研究PD的發(fā)病機制和神經保護方面,選擇性蛋白酶抑制劑乳胞素在以黑質(SN)為靶標誘導的老鼠模型中被證實有效。他們使用2型腺病毒相關載體(AAV2)編碼的GDNF注入到動物模型的紋狀體中檢測GDNF基因療法的效果和可能機制，結果表明AAV2介導的GDNF基因療法顯著減弱了乳胞素誘導的黑質和紋狀體DA神經元丟失的水平，還發(fā)現(xiàn)GDNF蛋白主要表達在室管膜下層區(qū)域(SVZ)和齒狀回(DG)的星形膠質細胞中。提出AAV2介導的GDNF基因療法能保護黑質DA神經元由UPS損傷介導的退化，其一部分起因于黑質DA神經在腦中再生，且可以用于治療PD。

2 GDNF對DA神經元的影響

PD相關蛋白的基因突變: PINK1和LRRK2導致活性氧(ROS)形成前線粒體功能受損，多種通路通過這些基因突變受抑制不可避免的引起神經細胞損傷[17]，使中腦DA神經元退化引起紋狀體DA不足導致PD標志性運動癥狀。在動物PD模型中GDNF可以改善神經退行性變和促進DA系統(tǒng)伴隨毒性損害的修復，然而Fredrik等[18]的臨床研究產生了混合的結果，GDNF在SYN高表達的基因動物模型中無效。線粒體損傷引起的DA神經元進行性退化的PD老鼠模型中，發(fā)現(xiàn)GDNF通過腺相關病毒或通過微滲透泵傳送到紋狀體，部分減輕了漸進的運動癥狀，但沒有改善神經退行性變的比率。這些行為變化伴隨著中腦DA水平的增加，但不是在紋狀體中。在高位置的GDNF反而減少了紋狀體的DA水平，這些結果證實了GDNF在漸進性DA系統(tǒng)損傷中是有潛能的療法。Luis等[19-20]的嚙齒動物模型PD中表明調節(jié)GDNF可以保護神經元，改善動物運動行為有效的調節(jié)了病態(tài)。Feng等[21]進行GDNF在6-OHDA誘導的PD細胞模型中潛在的神經保護機制的研究中，發(fā)現(xiàn)了17個以前未被報道過的基因，并提出GDNF在6-OHDA誘導的損害MN9D細胞的PD模型中促進了保護基因的表達、抑制了凋亡相關基因的表達,這項研究對于GDNF在DA神經元中的保護機制的研究提供許多特殊的有潛能的候選基因。胚胎干細胞(ESCs)療法已經越來越多的認識是一種臨床必需的療法[22]，通過神經再生的過程替換或供養(yǎng)PD潛在的功能損害的細胞。Tian-wei等[23]移植老鼠的ESCs CGR8，CGR8穩(wěn)定表達了GDNF和酪氨酸羥化酶(TH), 進入由6-OHDA 誘導的PD大鼠損傷的Str或Str-SN中拯救了大鼠的不正常行為，提出在SN-Str意義重大的功能損害至少部分由基于ESCs表達的TH和GDNF所修復，這可以成為一種治療PD有價值的工具。Zhenhua等[24]的研究調查了獼猴自體間充質干細胞(MSCs)防護MPTP誘導損傷所表達GDNF(GDNF-MSCs)的功能。MSCs起源于獼猴體內骨髓并基因修飾后表達GDNF, 隨后單側移植GDNF-MSCs進入紋狀體和黑質中，獼猴受到MPTP誘導成穩(wěn)定的系統(tǒng)性PD狀態(tài)，運動的功能不僅在接受MSCs的部位還在接受GDNF-MSCs的對側肢體也未受到侵害，在腦橋的Str中DA水平和DA再攝取均提高。這個結果建議自體的MSCs可能是一種為提高黑質紋狀體功能而傳送GDNF的安全載體。Dezhi等[25]在PD大鼠模型中慢病毒介導的TH和GDNF基因工程的間充質干細胞(MSCs)的研究中，證明結合MSCs的移植表達TH和GDNF能在治療大鼠PD模型中產生顯著療效。Ofelia等[26]的試驗顯示，在Str中注射GDNF增加了雜合Gdnf+/小鼠的肌肉活動的水平與野生型(WT)對照小鼠持平，且此作用可以維持整整4周。Gdnf+/小鼠運動的增加伴隨著在紋狀體GDNF蛋白質水平和SN GDNF增加增加40%。此外，GDNF療法顯著增加了中年Gdnf+/小鼠SN中TH陽性神經元(positive neurons)的數(shù)量，這與在SN中氧化應激的減少配合在一起。這些研究進一步支持了與黑質紋狀體通路的功能障礙有關的這種長期的變化是受GDNF表達的影響，并且這種功能障礙似乎對GDNF治療敏感。此外，這些研究說明長期的GDNF消耗改變了對GDNF治療的生物學和行為的反應，GDNF可以部分還原在Str-SN-DA系統(tǒng)中年齡相關的加速衰退和運動功能，減輕SN中神經炎癥和氧化應激。Agnieszka等[27]闡明PD退化在單側黑質Str-SN中6-羥多巴胺6-hydroxydopamine (6-OHDA)損傷的大鼠中，血清2型腺相關病毒(AAV2)與GDNF的作用。通過灌入到紋狀體(ST)中的載體被運送到SN), SN的致密部(SNc)和網狀部(SNr)，觀察在受損大腦半球的GDNF免疫反應，結果證明AAV2專門通過順行轉運到整個SN-Str。這個傳輸現(xiàn)象直接表達GDNF到整個基地神經節(jié)區(qū)域，對PD是不利影響(除SNc外)。GDNF可以保護DA神經元免受6-羥多巴胺(6-OHDA)的毒性, Ann等[28]的研究證實了此結論，GDNF防止了DA細胞的死亡和Str內DA容量的丟失，但是需要幾周時間完全修復DA能的表型，這些結果提供了深刻了解GDNF保護DA神經元的機制，并幫助避免錯誤的解釋暫時表型的改變。ANASTAS?A等[29]的研究有力地證實了GDNF在6-OHDA損傷的大鼠模型電休克(ECS)療法中有神經保護作用。Zhang等[30]通過沿神經生長因子-1(netrin-1)和GDNF通路實現(xiàn)了長距離定向生長多巴胺能的軸突，這種長距離的軸突導向技術證明了在重建損傷的神經循環(huán)，即在PD中黑質紋狀體通路是一種有益策略。

3 GDNF機制在治療PD中的應用及展望

由于GDNF同源二聚體的結構使得它不適合運輸通過血腦屏障(BBB), 所以由于它的尺寸使移植GDNF微?；蜣D染細胞進入人腦是有限的，Richardson 等[31]使用一種新的介入性的核磁共振成像(iMRI)技術在PD患者的黑質中輸入GDNF,實現(xiàn)了GDNF在硬膜運動區(qū)廣泛表達。Eduardo等[32]使用哺乳動物細胞衍生系統(tǒng)進行一種快速、簡單的獲取大量純化人源GDNF(hGDNF)的方法，由塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)誘導強大的哺乳動物細胞中宿主細胞蛋白質的合成。FLETCHER等[33]的研究目標是把hGDNF表達在大鼠Str中作為一種壓縮的DNA納米顆粒(DNP)，將hGDNF長期在生物活性水平表達來治療PD，結果觀察到在腦內注射DNA血漿編碼的hGDNF長期且穩(wěn)定的活性水平比基線高出了300%～400%。替米沙坦(TEL)是血管緊張素-1受體(AT1R)拮抗劑，已經有報告運用TEL的神經保護作用治療PD的動物模型。Sekar等[34]通過研究C57BL/6J老鼠的多巴胺轉運蛋白(DAT)和TH中蛋白質表達的調節(jié)，確定了TEL在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氫吡啶(MPTP)誘導的運動功能障礙和DA退化中的作用，提出腦內腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在PD患者的運動功能和調節(jié)關鍵蛋白(如SYN、BDNF、TH)中起決定性作用，AT1R拮抗劑能夠改善PD運動功能并可作為有潛能的神經保護藥。GDNF的神經保護作用已經在各種PD毒性模型中廣泛研究，然而這種神經保護作用是否能夠防御易聚合蛋白SYN誘導的毒性仍然未知。Mickael等[35]的研究針對在SN-Str人類野生型SYN的過表達，使用腺病毒相關的載體在SN的DA神經元產生一種漸進性退化，并產生在Str軸突的病理過程。結果發(fā)現(xiàn)量化紋狀體中SYN的陽性聚合物揭示了GDNF對SYN的聚集無效等一系列證據(jù)證明了在PD的體內模型中GDNF缺乏抵御人類野生型a-synuclein神經保護作用。此研究觀察到PD明確的機理是與自由基的應激和線粒體的損傷(以6-OHDA和MPTP處理過的動物模型)僅僅是復雜神經病理級聯(lián)反應導致神經元功能障礙和細胞死亡的一部分，未來應該使用綜合性臨床前模型或不同的發(fā)病機制來揭示人類疾病。目前對GDNF 的研究還限于實驗室階段，對其信號轉導途徑和作用機制還需要深入研究。GDNF促進癲癇后神經損傷作用已經得到很多實驗的證實，GDNF治療將是今后研究PD損傷后神經保護治療的方向之一。如何將外源性GDNF靶向性地導入病變腦區(qū)，如何更好地調節(jié)內源性GDNF及其受體系統(tǒng)的表達，如何有效地調控GDNF相關的信號轉導通路都是進一步要探究的內容。

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