心房顫動(dòng)早期階段心房肌細(xì)胞小電導(dǎo)鈣激活鉀通道的功能改變

于 濤，劉 影，俞曉立，林 偉

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣州510260)

心房顫動(dòng)(AF)是臨床常見病，心房重構(gòu)是其重要病理生理基礎(chǔ)。小電導(dǎo)鈣激活鉀(SK)通道是鈣激活鉀通道家族成員，包括3種亞型(SK1～3)，是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)控與細(xì)胞膜電活動(dòng)的重要離子通道。近年來發(fā)現(xiàn)，SK通道呈“心房選擇性”分布，且與AF發(fā)生密切相關(guān)。本課題組前期工作［1］首次證實(shí)，慢性AF患者心房肌細(xì)胞SK1、SK2亞型下調(diào)。但在AF早期階段，SK通道功能如何變化卻存在爭(zhēng)議。本研究觀察SK通道在AF早期階段心房肌細(xì)胞中的功能變化并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 成年雄性比格犬8只，體質(zhì)量13～15 kg。分為快速心房起搏組5只與對(duì)照組3只。

1.2 方法

1.2.1 快速心房起搏犬模型的制備 快速心房起搏組犬置于無菌環(huán)境、全麻狀態(tài)下(氯胺酮5.0 mg/kg+地西泮 0.2 mg/kg，靜脈注射;1.5%異氟醚吸入)，氣管插管后機(jī)械通氣(潮氣量10 mL/kg，頻率20次/min)，于胸骨右緣第5肋間開胸，暴露心臟將起搏電極縫合在右心耳部，起搏器(華南理工大學(xué)電子研究所制作，輸出電壓4 V，脈寬0.5 ms)頻率調(diào)至400次/min，持續(xù)起搏4 h。對(duì)照組手術(shù)方法相同，但不進(jìn)行起搏。

1.2.2 膜片鉗全細(xì)胞記錄

1.2.2.1 心房肌細(xì)胞分離 采用自制改良的Langendorff灌流法和自制的冠脈插管裝置［2］。分離后的左心房肌細(xì)胞保存在改良KB液中，室溫下靜置孵育6 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 全細(xì)胞鈣激活鉀電流(IK，Ca)記錄 選取紋理清晰、桿狀和大小適中的細(xì)胞在24℃條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將適量細(xì)胞(約1.5 mL)放于倒置顯微鏡(OLPUS IX 70型，日本)的細(xì)胞池中，貼壁8 min后，開始實(shí)驗(yàn)，灌流速度約1.5 mL/min。在電極拉制儀(Narishige PP830型，日本)分兩部拉制電極，灌電極液后電阻為2～4 MΩ，并置于推進(jìn)器上，通過三維操縱器(Narishige，日本)驅(qū)動(dòng)電極，并輕壓在細(xì)胞表面。用負(fù)壓使電極與細(xì)胞表面形成高阻封接后，用ZAP或給負(fù)壓破膜，給予電容及串聯(lián)電阻補(bǔ)償，形成全細(xì)胞記錄。電流信號(hào)經(jīng)Ag/AgCl電極引導(dǎo)，由膜片鉗AXON 200B放大器放大通過AD/DA轉(zhuǎn)換板(AXON DigiDatal 200，美國(guó))，存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)硬盤中。實(shí)驗(yàn)過程由pClAMP9.0軟件程序(AXON，美國(guó))刺激發(fā)放和信號(hào)采集。采用pCLAMP9.0軟件對(duì)單個(gè)全細(xì)胞記錄進(jìn)行數(shù)據(jù)和圖形轉(zhuǎn)換，Prism3.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合及繪制離子通道電流密度—電壓(Ⅰ-Ⅴ)曲線。根據(jù)文獻(xiàn)［3，4］，本研究中將電極內(nèi)液的游離 Ca2+濃度設(shè)定為1 000 nmol/L，以最大限度地保證SK通道激活。形成全細(xì)胞封接狀態(tài)后，將細(xì)胞鉗制在－55 mV，給予指令電位從－100 mV～+80 mV，步長(zhǎng)20 mV，波寬為500 ms的刺激。記錄用藥前電流后，用含SK通道特異性阻斷劑蜂毒明肽(100 nmol/L)的電極外液灌流3 min，再次記錄電流，給蜂毒明肽前后的電流相減獲得“蜂毒明肽敏感性電流”，此電流即“IK，Ca”。記錄每個(gè)細(xì)胞電容，計(jì)算電流密度(pA/pF)=電流(pA)/電容(pF)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，組間數(shù)據(jù)比較采用Student's t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

全部犬順利完成實(shí)驗(yàn)，每只犬至少取3個(gè)心房肌細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。當(dāng)鉗制電位為－100 mV時(shí)，快速心房起搏組心房肌細(xì)胞電流密度為(－1.7±0.3)pA/pF，對(duì)照組為(－0.7±0.1)pA/pF，P ＜0.01;+80 mV時(shí)，快速心房起搏組心房肌細(xì)胞電流密度為(4.1±0.6)pA/pF，對(duì)照組為(－1.6±0.2)pA/pF，P ＜0.01。

3 討論

SK通道家族的特性是電壓非依賴性、僅由細(xì)胞內(nèi)的Ca2+激活和可被蜂毒明肽特異性阻斷，蜂毒明肽對(duì)SK通道有高度選擇性，對(duì)其他離子通道則不敏感［5］。

SK通道是細(xì)胞內(nèi)的鈣調(diào)控和細(xì)胞膜的電活動(dòng)之間的重要功能鏈接［6］。AF的發(fā)生、發(fā)展與離子通道表達(dá)異常和細(xì)胞內(nèi)的鈣調(diào)控失常密切相關(guān)［7］。Li等［8］發(fā)現(xiàn)，SK2基因敲除小鼠的心肌細(xì)胞動(dòng)作電位延長(zhǎng)，更易于誘發(fā) AF。Ellinor等［9］發(fā)現(xiàn)，人類1q21位點(diǎn)的KCNN3(SK3)基因多態(tài)性與孤立性AF的發(fā)生相關(guān)。最近3項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［10～12］結(jié)果顯示，阻斷SK通道可以中止AF的發(fā)作，提示SK通道可能是一種新型的AF相關(guān)性離子通道［13］。Tuteja等［3］和Xu等［4］的研究證實(shí)，SK1和SK2通道呈“心房選擇性”分布。該特性使SK通道極有可能成為新的“選擇性”治療AF的藥物靶點(diǎn)［14］，即特異性阻斷SK通道的藥物可以有效治療或預(yù)防AF，且無其他抗心律失常藥物常見的致室性心律失常的風(fēng)險(xiǎn)。

我們的前期實(shí)驗(yàn)［1］已經(jīng)證實(shí)，慢性AF(AF維持階段)患者心房肌細(xì)胞中IK，Ca電流密度減低、SK1和SK2表達(dá)下調(diào)。但Nagy等［15］報(bào)道，在生理狀態(tài)下，大鼠、犬和人心室肌細(xì)胞的SK2通道處于失活狀態(tài)，對(duì)動(dòng)作電位的復(fù)極化過程不產(chǎn)生影響。Ozgen等［16］的研究顯示，短時(shí)間(3 h)快速起搏(模擬AF早期階段)可使兔肺靜脈肌袖細(xì)胞IK，Ca電流密度增強(qiáng)，SK2亞型表達(dá)增加，但該研究是在離體組織模型上進(jìn)行的。本研究采用活體犬AF模型，結(jié)果顯示IK，Ca電流密度在AF早期階段增強(qiáng)。該結(jié)果與Nagy等［15］的研究結(jié)果吻合。這說明SK通道在AF的不同時(shí)期功能變化不同，即SK通道在AF初始(早期)階段和維持階段(慢性AF)呈“矛盾性重構(gòu)”改變。

綜上所述，SK通道的功能上調(diào)是AF初始階段的重要分子機(jī)制之一。由此推測(cè)，未來開發(fā)新型的特異性SK通道阻斷劑，并預(yù)防性應(yīng)用于AF高危人群中，可能大大降低AF的發(fā)生率。

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