Tail-Cuff技術(shù)改良大鼠頸部異位心臟移植模型的效果觀察

張金敏，張松林，魏 蕾

(1武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，武漢430071;2三峽大學(xué)心血管病研究所)

大鼠頸部心臟移植模型由Heron［1］于1971年創(chuàng)立，該模型具有手術(shù)創(chuàng)傷輕、移植物觀察靈敏等優(yōu)點(diǎn)。但由于頸總動(dòng)脈與升主動(dòng)脈直徑差別較大，該方法對顯微技術(shù)要求較高，手術(shù)時(shí)間長，移植物缺血損傷加重，從而限制了其在醫(yī)學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用。較多文獻(xiàn)［2～5］報(bào)道，利用套管技術(shù)(Cuff技術(shù))對頸部異位心臟移植模型進(jìn)行改良，可明顯縮短手術(shù)操作時(shí)間，提高手術(shù)成功率;但由于在Cuff管的根部缺乏固定的支撐點(diǎn)，翻轉(zhuǎn)血管時(shí)Cuff管易滑動(dòng)，手術(shù)往往需花費(fèi)較長時(shí)間。2012年9月～2013年3月，本研究在總結(jié)我們以前應(yīng)用Tail-cuff技術(shù)帶尾套管法建立小鼠頸部異位心臟移植模型的基礎(chǔ)上［6，7］，應(yīng)用靜脈內(nèi)導(dǎo)管制作成帶有尾巴的套管(Tail-cuff)對大鼠頸部異位心臟移植模型的操作進(jìn)一步改良?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用清潔級封閉群Wistar大鼠(200～250 g)和SD大鼠(230～300 g)，雌雄不限，分別由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 手術(shù)材料 ZEISS手術(shù)顯微鏡(ZEISS光學(xué)儀器國際貿(mào)易有限公司);顯微手術(shù)器械包(寧波醫(yī)用縫針有限公司);5-0～10-0顯微縫線(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司)。應(yīng)用22 G和20 G靜脈內(nèi)套管(BD IntimaⅡTM，蘇州BD公司生產(chǎn))制作Tail-cuff管，該管體長約1.2 mm，尾長約0.5 mm，尾寬約為管周長的1/3～1/2;動(dòng)脈套管內(nèi)徑約為0.7 mm，靜脈套管內(nèi)徑約為1.2 mm;管體中部劃一刻痕，以避免結(jié)扎的線結(jié)脫落。

1.1.3 主要試劑 肝素鈉注射液(2 mL/12 500 U)，St.Thomas液，3 g/L 戊巴比妥鈉鹽水溶液，4%多聚甲醛(武漢博士德公司)。

1.2 方法

1.2.1 麻醉方法 采用SD大鼠→SD大鼠進(jìn)行同系心臟移植(n=20)，Wistar大鼠→SD大鼠進(jìn)行同種心臟移植(n=24)。供、受者麻醉均用3 g/L的戊巴比妥鈉鹽水溶液腹腔注射，劑量分別為30、40 mg/kg。所有操作由單人完成。

1.2.2 移植物獲取 參照既往文獻(xiàn)［2，8～10］并稍作改進(jìn)，采用腹部正中切口，經(jīng)下腔靜脈注射肝素2 mL(100 U/mL)，2 min后采用U形切口開胸，剪開心包后阻斷主動(dòng)脈弓遠(yuǎn)端，經(jīng)頭臂動(dòng)脈注射心臟冷停搏液5 mL，心表面輔以冰屑保護(hù)心肌。分別進(jìn)行胸腺摘取、結(jié)扎切斷右上腔靜脈、右心耳及下腔靜脈、左上腔靜脈、左心耳、肺靜脈等結(jié)構(gòu)的操作，分離主肺動(dòng)脈間隙軟組織后，在頭臂動(dòng)脈近心端切斷升主動(dòng)脈及在左右肺動(dòng)脈分叉水平切斷肺動(dòng)脈遠(yuǎn)端，供心取出后以4℃的生理鹽水沖洗，分離主肺動(dòng)脈間隙，然后保存在4℃的St.Thomas液中。

1.2.3 受體血管準(zhǔn)備 右頸部縱行切開皮膚，摘除右頜下腺及軟組織。暴露右頸外靜脈，結(jié)扎后去除分支。在右胸鎖乳突肌及氣管之間，暴露右頸動(dòng)脈。近心端以無創(chuàng)血管夾阻斷后，分別在頸內(nèi)外動(dòng)脈及頸外靜脈分叉平面結(jié)扎切斷分支及屬支。近心端血管腔以肝素鹽水沖洗。在頸外靜脈近心端游離緣以10-0縫線縫置1針，然后帶針線一起穿過帶尾的靜脈套管(尾部向血管夾)。用顯微血管鑷夾住靜脈遠(yuǎn)心端并稍向上提，用另一顯微鑷把靜脈套管盡可能推向近心端，然后用血管夾把套管尾巴及近心端血管同時(shí)固定。最后用兩把顯微鑷對血管游離緣進(jìn)行翻卷，8-0絲線環(huán)形結(jié)扎固定在預(yù)先劃好的刻痕上。同法準(zhǔn)備右頸總動(dòng)脈。

1.2.4 移植物植入 供心表面輔以一薄層棉墊，間斷性注射4℃生理鹽水以減輕供心熱缺血損傷。右頸外靜脈套管與供心肺動(dòng)脈連接，用一預(yù)置的8-0絲線環(huán)形結(jié)扎固定;同法連接右頸總動(dòng)脈套管與供心升主動(dòng)脈。按順序移去右頸外靜脈及頸總動(dòng)脈近心端血管夾。心臟移植物顏色迅速由蒼白轉(zhuǎn)為紅潤，60 s左右復(fù)跳。以5-0縫線連續(xù)縫合頸部切口。

1.2.5 術(shù)后觀察與處理 術(shù)后腹腔注射生理鹽水2 mL，一次性肌注青霉素鈉(500 U/10 g)。獨(dú)籠飼養(yǎng)，保溫。每日觸診頸部心跳情況以評估心功能，持續(xù)心跳≥72 h定為手術(shù)成功。分別于移植后第5天和第28天對同種移植物和同系移植物取心肌組織，以4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片，進(jìn)行HE染色。

1.2.6 主要觀察指標(biāo) 記錄總操作時(shí)間、手術(shù)成功率、手術(shù)并發(fā)癥、移植心存活時(shí)間及病理學(xué)改變。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 共44只大鼠正式實(shí)驗(yàn)，20只同系移植，24只同種移植，手術(shù)成功率100%(44/44)。沒有麻醉、出血和血栓形成等并發(fā)癥。移植時(shí)間(40.2±6.8)min，翻卷血管和供受體血管連接時(shí)間分別為(3.8±1.1)、(2.7±1.3)min。同種移植物生存時(shí)間為(6.7±1.8)d，同系移植物生存時(shí)間超過28 d。

2.2 病理學(xué)切片觀察 同系移植組心肌組織形態(tài)大致正常，僅見少量炎性細(xì)胞浸潤;同種移植組心肌組織見大量彌漫性多類型細(xì)胞浸潤，伴水腫、出血和心肌細(xì)胞壞死。

3 討論

大鼠頸部心臟移植具有明顯優(yōu)勢［11，12］:①創(chuàng)傷小;②感染率低;③易于觀察心跳情況;④術(shù)后存活率高等。但因大鼠血管較細(xì)且升主動(dòng)脈與頸總動(dòng)脈口徑相差較大，進(jìn)行顯微吻合較為困難。套管技術(shù)的引入，大大縮短操作時(shí)間及心臟缺血時(shí)間。但套管技術(shù)的核心是如何把游離緣的血管翻卷到套管上并固定。在用套管法建立小鼠頸部心臟移植模型中，Matsuura等［13］的方法是在受體血管游離緣縫置3針固定牽引線，然后均勻用力翻卷，需要雙人操作，亦需要一定的顯微外科操作基礎(chǔ)。Wang等［14］及宋光民等［2］的方法是將供心的無名動(dòng)脈套在備好的受體頸總動(dòng)脈套管外，將翻轉(zhuǎn)好的供心肺動(dòng)脈插入受體頸外靜脈內(nèi)，結(jié)扎固定。我們的體會(huì)是肺動(dòng)脈主干很短，不利于制作靜脈套管，且可人為縮小血管口徑。此外，該方法導(dǎo)致移植物血管蒂較長，易扭曲受壓;套管根部不能固定，翻卷血管時(shí)套管易于滑動(dòng)，往往花費(fèi)很長時(shí)間翻卷血管，加重心肌缺血。而有的研究者為了固定套管根部，在血管近心端插入一個(gè)針芯［15，16］，這樣容易損傷血管內(nèi)膜導(dǎo)致血栓形成。

本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用Tail-cuff管，很好地解決了套管根部缺乏支撐點(diǎn)的問題。把套管尾巴與血管同時(shí)固定在同一血管夾中，套管根部不再滑動(dòng)，極易翻卷游離緣血管。此外，用22 G和20 G靜脈留置管制作Tail-cuff管，壁薄，內(nèi)徑較大，因此供心血流量增加，靜脈回流通暢;右頸總動(dòng)脈與升主動(dòng)脈連接，縮短移植物血管蒂長度避免扭曲受壓;血管連接處為光滑而完整的血管內(nèi)膜，對血管損傷輕，避免了血管內(nèi)皮損傷而引起的血栓栓塞等并發(fā)癥。整個(gè)過程由單人完成，不需要專門練習(xí)顯微操作。該方法的使用，明顯減少了吻合口出血、狹窄等并發(fā)癥［11，17］，明顯縮短心臟缺血時(shí)間，主要是縮短了翻卷血管和連接血管的時(shí)間，并顯示了很高的手術(shù)成功率和術(shù)后生存率。但該方法仍然需要遵循一定的的學(xué)習(xí)曲線，本研究中正式實(shí)驗(yàn)較為滿意的結(jié)果是在充分總結(jié)預(yù)實(shí)驗(yàn)失敗的經(jīng)驗(yàn)上取得的。

此外，提高該手術(shù)成功率需要注意以下幾點(diǎn):①套管中部劃一刻痕，避免線結(jié)環(huán)形固定后松脫，尤其是心臟復(fù)跳以后;②制作套管尾巴時(shí)其寬度為管周長的1/3～1/2，以避免套管尾巴與受體血管同時(shí)固定在同一血管夾后持續(xù)滲血;③避免翻卷時(shí)扭轉(zhuǎn)受體血管，導(dǎo)致血管連接后不甚通暢，因此在翻卷血管前記住固定線的方向很重要;④我們認(rèn)為不必要切除右側(cè)胸鎖乳頭肌，一方面是避免慢性滲血，更重要的是供心移植后肺動(dòng)脈和主動(dòng)脈正好騎跨在胸鎖乳頭肌的兩側(cè)，避免了復(fù)跳后的供心扭轉(zhuǎn)。

總之，該方法的改進(jìn)更利于供受體血管的吻合，縮短了心肌缺血時(shí)間，顯示了極高的手術(shù)成功率。因此，應(yīng)用Tail-cuff技術(shù)對于建立大鼠頸部異位心臟移植模型顯示出一定的優(yōu)越性，是一種理想的方法。該技術(shù)建立的模型適宜用于移植誘導(dǎo)的缺血再灌注損傷和免疫排斥反應(yīng)的研究。

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