RNA干擾治療技術(shù)的應(yīng)用研究

錢 江，傅仲學(xué)

(1重慶市墊江縣中醫(yī)院，重慶408300;2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬一院)

RNA干擾(RNAi)是20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的一種在進(jìn)化過程中具有保守作用的特異性序列，是由dsRNA介導(dǎo)的、存在于動(dòng)物和植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，最先在矮牽牛屬植物中發(fā)現(xiàn)［1］。一些體外和體內(nèi)研究表明，絕大多數(shù)疾病是由于部分基因的遺傳損傷或過度表達(dá)所致，因此這部分基因成為以RNAi技術(shù)為基礎(chǔ)的臨床治療方法的潛在目標(biāo)［2］。動(dòng)物模型研究表明，以RNAi技術(shù)為基礎(chǔ)的藥物可以有效地治療各種疾?。?］。目前正在開發(fā)用于治療年齡相關(guān)性黃斑變性的RNAi療法，只需直接噴射含有血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的特異性短干擾RNA(siRNA)進(jìn)入玻璃體腔內(nèi)，從而有效地將siRNA注射入眼球中。運(yùn)用RNAi療法可直接將siRNA注入肺組織內(nèi)治療呼吸道合胞病毒感染而引起的肺炎。然而，以RNAi技術(shù)為基礎(chǔ)治療其他疾病，特別是在治療腫瘤方面的開發(fā)和利用以及將siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)至靶組織中的研究和開發(fā)工作更有重要意義。

1 RNAi療法治療腫瘤

腫瘤是RNAi基礎(chǔ)治療的主要目標(biāo)之一，腫瘤基因、腫瘤抑制基因的突變和其他促進(jìn)腫瘤發(fā)展的基因都可以成為RNAi基因沉默技術(shù)應(yīng)用的重要潛在目標(biāo)。由于作用機(jī)制確切、高特異性和高效率，RNAi介導(dǎo)的基因沉默可以減少與化療藥物密切相關(guān)的不良反應(yīng)。RNAi主要優(yōu)勢是可以同時(shí)針對腫瘤進(jìn)展中涉及不同細(xì)胞途徑的多個(gè)基因進(jìn)行治療，可以將以小分子為基礎(chǔ)治療腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥性的概率降到最低。以RNAi技術(shù)為基礎(chǔ)療法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以開發(fā)適用于特定患者的個(gè)性化抗癌藥物，這種個(gè)性化的藥物可以更有效地控制腫瘤，從而提高藥物治療腫瘤的成功率。CALAA-01是轉(zhuǎn)鐵蛋白靶受體，是用納米封裝的非化學(xué)修飾的siRNA特定的核糖核苷酸還原酶 M2亞基(RRM2)，參與DNA的復(fù)制。CALAA-01結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和釋放含有RRM2特異性的siRNA通過細(xì)胞內(nèi)吞作用后，抑制RRM2基因的表達(dá)，從而防止轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在腫瘤細(xì)胞中的增殖。已有醫(yī)藥公司進(jìn)行了針對實(shí)體瘤患者的全身用藥的CALAA-01的Ⅰ期臨床試驗(yàn)［4］，從黑色素瘤患者治療后的腫瘤活組織切片檢查顯示細(xì)胞內(nèi)的局部有納米粒子的存在，并在基因和蛋白水平降低RRM2的表達(dá)。Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)表明，CALAA-01的siRNA患者的全身給藥，可以沉默腫瘤細(xì)胞中的與腫瘤相關(guān)的基因［4］。

2 siRNA治療的藥代動(dòng)力學(xué)策略

目前，研究者所面臨的主要問題是以siRNA為基礎(chǔ)治療腫瘤和其他疾病時(shí)如何提供針對siRNA的體內(nèi)靶細(xì)胞群。以siRNA為基礎(chǔ)的抗腫瘤藥物的療效，取決于強(qiáng)而有效的腫瘤細(xì)胞基因沉默，實(shí)現(xiàn)有效的體內(nèi)基因敲除需要將siRNA送至靶組織。siRNA分子的高負(fù)電荷使其在體內(nèi)的吸收效率降低;而且核內(nèi)體的siRNA降解與快速清除是經(jīng)血液通過腎臟排泄的，因此siRNA通過靜脈途徑進(jìn)入體內(nèi)后，其效力也將大大降低。為了實(shí)現(xiàn)有效的siRNA傳遞與基因沉默治療，需要一個(gè)理想的藥物遞送系統(tǒng)保護(hù)siRNA不受核酸酶的降解，并提高其穩(wěn)定性，防止非靶組織的非特異性攝取，并提高治療靶細(xì)胞和組織攝取siRNA［5］。對于局部攝取，未修飾的siRNA可以簡單的配方(如生理鹽水)局部應(yīng)用在各種組織中包括呼吸道上皮細(xì)胞、眼和中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起明顯的基因沉默效果［6］。全身用藥時(shí)，siRNA的傳送面臨巨大挑戰(zhàn)。未加任何藥物生理鹽水配制的siRNA靜脈注射后在血清由核酸酶降解，并經(jīng)腎臟快速排泄出體外。因此，如果嘗試全身siRNA用藥，需要提高siRNA血清半衰期，使其能分布到靶組織，在其靶細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)釋放，才不會(huì)降低隨后的攝取，并避免脫靶基因沉默活性的降低。

為提高基因沉默活性的效率，siRNA的化學(xué)修飾必不可少，因?yàn)檫@些修飾的siRNA可保持其在血清中的穩(wěn)定性［7～9］。一個(gè)理想的修飾應(yīng)加強(qiáng)siRNA的穩(wěn)定性，而不會(huì)影響其基因沉默活性。siRNA在核糖環(huán)的2’位置上的修飾已被證明可以防止核酸內(nèi)切酶的降解，增加siRNA的穩(wěn)定性。其他包括在2’-O-甲基、2’-脫氧-2’-氟上的修飾，能提高血清的siRNA的穩(wěn)定性，并提高其在體內(nèi)的效力。通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用或通過膜透性的增加，帶負(fù)電荷的siRNA與膽固醇的共軛可以增強(qiáng)的siRNA的攝?。?0］。Soutschek 等［11］報(bào)道，膽固醇共軛的 siRNA的靶向載脂蛋白B，可以增加siRNA在血清中的穩(wěn)定性和增強(qiáng)其基因沉默活性。據(jù)觀察，血清膽固醇載脂蛋白B特異siRNA的共軛與通過靜脈內(nèi)給藥的未結(jié)合的對照組相比，可以使siRNA腎清除率明顯下降，并使血清半衰期增加16倍。更重要的是，膽固醇共軛也促進(jìn)了受體siRNA介導(dǎo)的肝細(xì)胞的攝取，并使小鼠肝臟中60%的載脂蛋白B基因沉默。與膽固醇的共軛siRNA治療方法更加有助于將siRNA傳遞到肝臟，從而形成一種有效的治療肝癌的方法。

siRNA體積小(平均粒徑＜10 nm)，未配制的siRNA可以很容易地從人體排泄，從而出現(xiàn)siRNA的生物利用度降低，藥代動(dòng)力學(xué)特性較差［12］。有研究通過核酸酶提高siRNA的粒徑，并防止其降解，專門設(shè)計(jì)納米顆粒較大(50～200 nm)的siRNA以抑制小鼠模型中的腫瘤生長［13］。這些納米粒子，由共軛生物惰性聚合物直接插入siRNA或者制備封裝siRNA的脂質(zhì)體構(gòu)成，在血清中較穩(wěn)定，可提高藥代動(dòng)力學(xué)效能，從而改善這些治療分子的生物利用度。有效地將siRNA傳遞至靶組織，納米粒子的大小非常重要。研究顯示，納米粒子大小從10～200 nm的被視為最優(yōu);因?yàn)橥ㄟ^受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，小到足以穿過細(xì)胞膜，大到足以被保留在人體內(nèi)，從而提高siRNA的治療效果［14］。

3 siRNA靶組織傳遞特異性及安全性

改善siRNA靶組織傳遞特異性，應(yīng)使有治療作用的siRNA定位在腫瘤細(xì)胞，避免定位在正常細(xì)胞。目前已經(jīng)制定了一些促進(jìn)細(xì)胞類型特異性siRNA傳遞的策略，包括抗體，配體及核酸適配體。抗體對特定的抗原具有極高的親和力和選擇性識別能力。抗體片段有眾多的抗原識別域，如識別艾滋病毒包膜糖蛋白的一個(gè)高度帶正電的魚精蛋白能成功傳遞siRNA的靶向HIV序列至病毒感染的CD4+T細(xì)胞，從而抑制病毒的復(fù)制。此外，靜脈注射抗血管生成的siRNA絡(luò)合Fab-魚精蛋白的融合蛋白成功定位至皮下植入的腫瘤細(xì)胞，可抑制腫瘤生長［15］。此外，細(xì)胞類型特異性傳遞方面也獲得了可用適配體，為高度結(jié)構(gòu)化的核酸分子(RNA和DNA)及與其親和的一個(gè)特定目標(biāo)分子。核酸適配體都是通過幾次綁定到達(dá)特定的細(xì)胞表面的靶抗原［16］，與單個(gè)RNA適配子可以直接連接到以siRNA分子為細(xì)胞特定類型產(chǎn)生的嵌合RNA中。與前列腺特異性膜抗原(PSMA)特異性結(jié)合的適配體將siRNA傳遞至前列腺癌細(xì)胞，抑制前列腺腫瘤在小鼠異種移植模型中的生長已被證明有效［17］。

除了特定目標(biāo)的siRNA傳遞，siRNA治療的另一問題是意外脫靶效應(yīng)［18］。以siRNA為基礎(chǔ)療法的傳遞和脫靶效應(yīng)是聯(lián)系在一起的，高效遞送siRNA至靶癌細(xì)胞會(huì)降低正常細(xì)胞的暴露數(shù)量，有利于腫瘤細(xì)胞吸收siRNA，從而減少了潛在的脫靶效應(yīng)。此外，siRNA有效傳遞到癌細(xì)胞也會(huì)減少siRNA治療劑量，從而最大限度地減少與治療劑量相關(guān)的不良反應(yīng)。siRNA治療的另一不良反應(yīng)是導(dǎo)致大量炎癥性細(xì)胞因子(如干擾素-α、腫瘤壞死因子-α和白介素-6)誘導(dǎo)的先天免疫系統(tǒng)的激活，導(dǎo)致免疫功能紊亂。因此，開發(fā)以siRNA為基礎(chǔ)的治療技術(shù)需慎重。

目前，臨床亟須有效方法阻止實(shí)體腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。以siRNA為基礎(chǔ)的治療方法對開發(fā)展新型有效的腫瘤治療藥物、減少藥物不良反應(yīng)有重要意義，有效的siRNA分子靶傳送至體內(nèi)癌細(xì)胞對治療效果至關(guān)重要［19］。多個(gè)siRNA分子通過不同細(xì)胞途徑特異性靶向治療各種腫瘤，同時(shí)沉默多個(gè)致癌基因，可有效抑制惡性腫瘤的增長。

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