細(xì)胞因子拮抗肽的制備、作用機(jī)制及應(yīng)用研究進(jìn)展

林 璐，葉 輝

(1溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，浙江溫州325035;2溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

細(xì)胞因子是由機(jī)體免疫細(xì)胞、免疫原、絲裂原(或其他刺激劑)及某些非免疫性細(xì)胞誘導(dǎo)、合成并分泌的小相對(duì)分子質(zhì)量的可溶性生物活性物質(zhì)，大多為多肽類或者小分子糖蛋白，在正常機(jī)體內(nèi)含量甚微，主要通過與靶細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合發(fā)揮作用［1］。細(xì)胞因子既具有介導(dǎo)靶向細(xì)胞間信號(hào)傳遞、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答、抗炎癥效應(yīng)、促進(jìn)造血、抗病毒感染、抗腫瘤侵蝕等重要生物活性，也與引起休克、過度免疫性疾病、生理變態(tài)反應(yīng)、器官移植排斥反應(yīng)等病理過程密切相關(guān)［2～5］。采用激活或抑制細(xì)胞因子或其受體的方法可治療細(xì)胞因子參與的疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、腦缺血損傷、多種癌癥等［6～9］。傳統(tǒng)的細(xì)胞因子抑制劑［10～13］主要包括天然黃酮類化合物、生物堿化合物以及木脂素、萜類等，其缺點(diǎn)是特異性不強(qiáng)、療效差［14］，且缺乏激活效果。拮抗肽是新型的細(xì)胞因子抑制劑，主要用于治療細(xì)胞因子分泌過多所致疾病，優(yōu)點(diǎn)是可以特異性匹配不同的細(xì)胞因子?，F(xiàn)將細(xì)胞因子拮抗肽的制備、作用機(jī)理及應(yīng)用研究進(jìn)展綜述如下。

1 細(xì)胞因子拮抗肽的制備

拮抗肽的制備方法因其性質(zhì)不同而異。對(duì)于許多天然拮抗肽，其分子構(gòu)成并不重要，重點(diǎn)在于體外的人工合成(逆向合成技術(shù)使用等)或者構(gòu)建新的表達(dá)體系;對(duì)于特定序列的肽鏈分子或其他小分子則可以利用已有的多肽文庫進(jìn)行細(xì)胞因子匹配篩選等。隨計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的發(fā)展，目前對(duì)于拮抗肽的定向設(shè)計(jì)和理性改造漸趨豐富。

1.1 構(gòu)建多肽文庫進(jìn)行特異性匹配篩選 利用小分子短肽模擬細(xì)胞因子或受體分子因具有合成簡單、較易形成高濃度工作區(qū)、抗原性毒副作用少等優(yōu)點(diǎn)，已用于許多細(xì)胞因子免疫性疾病中。構(gòu)建一個(gè)小分子多肽文庫就是在篩選合適拮抗肽的基礎(chǔ)上，利用“釣餌”(細(xì)胞因子，受體蛋白，信號(hào)傳遞物質(zhì)等)精確匹配出肽鏈序列以供后續(xù)合成。噬菌體肽庫是最常用的多肽文庫，即將編碼小分子肽鏈的外源基因插入到絲狀噬菌體基因Ⅲ(gⅢ)或Ⅶ(gⅦ)，以使目標(biāo)肽鏈能以融合蛋白形式連接在噬菌體分泌的PⅢ或PⅧ的N端，進(jìn)而展示在噬菌體顆粒表面，同時(shí)多肽的表達(dá)不干擾和影響噬菌體正常生活周期。2014 年 Yoshimoto等［15］與 Zheng 等［16］報(bào)道了以表皮生長因子(EGF)模擬肽的一級(jí)序列為基礎(chǔ)，結(jié)合其生理功能替換13、15、16、41、43和47位氨基酸殘基并將其誘變篩選構(gòu)建突變噬菌體肽庫，以靶細(xì)胞為“釣餌”匹配合成高親和力的激動(dòng)劑。也可用多個(gè)功能分子篩選目的片段以獲得最佳效果，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)能與激酶受體結(jié)合誘導(dǎo)血管生成并介導(dǎo)腫瘤血管增生，因此對(duì)其激酶插入?yún)^(qū)受體(KDR)的阻斷尤為重要。Binetruy-Tournaire等［17］分別用在細(xì)胞膜上表達(dá)的KDR和抗-VEGF的中和性單抗篩選噬菌體肽庫，獲得了拮抗性較高的短肽序列ATWLPPR，且順利通過體外實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。因此，對(duì)于小分子拮抗肽的肽庫篩選可非常靈活的依照需求設(shè)計(jì)方案、分析功能并完成驗(yàn)證。另外，還有細(xì)菌表達(dá)肽庫、核糖體肽庫甚至化學(xué)合成肽庫等也在研究領(lǐng)域中有較大的應(yīng)用前景。

1.2 建模分析、理性設(shè)計(jì) 根據(jù)細(xì)胞因子或受體構(gòu)象，模擬生理環(huán)境下的相互作用可以正確設(shè)計(jì)功能位點(diǎn)和輔助鏈，達(dá)到事半功倍的效果。如在TNF-α拮抗肽研究中，有學(xué)者基于鼠抗TNF-α中單抗Z-12能特異性識(shí)別TNF-α的141-146這一功能表位的特點(diǎn)，利用計(jì)算機(jī)理論模擬構(gòu)建了TNF/抗體的復(fù)合生理反應(yīng)模型，獲得功能性拮抗肽(PT2、PT3、PT4、PT7);利用人體抗體可變區(qū)重鏈框架(VHS)表達(dá)拮抗肽(PT2、PT3、PT4)設(shè)計(jì)了目標(biāo)單抗，并合成了活性顯著增加的單域抗體(PTVH5)。虛擬篩選庫的應(yīng)用減少了研究成本，也利于篩選出最優(yōu)的匹配結(jié)構(gòu)。在肝癌轉(zhuǎn)移抑制拮抗肽的發(fā)展中，有研究者通過分子動(dòng)力學(xué)模擬配體三維晶體結(jié)構(gòu)，并運(yùn)用分子對(duì)接與能量分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行HAbl8G/CD147胞外區(qū)受體與對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有高效抑制功能的12肽配體對(duì)接，將成果順序經(jīng)過預(yù)打分排序、結(jié)合自由能函數(shù)經(jīng)驗(yàn)性打分排序和結(jié)果的成簇處理等階段，最終獲得最優(yōu)對(duì)接結(jié)構(gòu)。通過對(duì)最優(yōu)對(duì)接結(jié)構(gòu)理論分析計(jì)算，得出受體和配體結(jié)合后復(fù)合物的結(jié)合區(qū)域與作用活性位點(diǎn)的詳細(xì)相互作用，是今后高效拮抗肽研究發(fā)展的方向。

1.3 體外表達(dá)體系構(gòu)建 在普通方法獲得的目標(biāo)產(chǎn)物數(shù)量不足以滿足研究需求時(shí)，就需要運(yùn)用合成生物學(xué)手段人工構(gòu)建體外產(chǎn)物表達(dá)體系。另外，許多細(xì)胞因子在生物體內(nèi)即有天然的拮抗劑或可溶性受體，此類拮抗肽可直接從機(jī)體分離獲取，但技術(shù)繁瑣、效率不高且花費(fèi)較大。隨基因工程標(biāo)準(zhǔn)化、模塊化的發(fā)展，各種工程菌株以及分子生物學(xué)操作工具的完善，構(gòu)建高效穩(wěn)定的表達(dá)體系變得十分便捷。表達(dá)體系的構(gòu)建通常是在前述兩種手段的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。如用于緩解強(qiáng)直性脊柱炎(AS)癥狀的拮抗肽基于阻斷HLA-B27信號(hào)途徑的治療性基因疫苗［18］，研究人員在前期工作中使用 HLA-B*2704及HLA-B*2705重鏈胞外區(qū)蛋白篩選噬菌體12肽隨機(jī)肽庫并獲得了能與其特異性結(jié)合的拮抗肽，然后針對(duì)HLA-B*2705-AP進(jìn)行pcDNA3.1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及后續(xù)表達(dá)鑒定，構(gòu)建了融合有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白編碼基因的 pcDNA3.1/HLA-B*2705-AP-EGFP的融合CHO細(xì)胞表達(dá)載體和pcDNA3.1/HLA-B*2705-AP-EGFP的融合 CHO細(xì)胞表達(dá)載體，為深入研究和臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。此外，在B細(xì)胞活化因子(BAFF)拮抗肽研究中，研究人員在前期工作中先以跨膜激活劑及鈣調(diào)親環(huán)素配體相互作用分子(TACI)和BAFF的3D結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)目標(biāo)拮抗肽，然后以pET-30a-BAFF1為基本表達(dá)載體，利用不同的內(nèi)切酶和引物克隆獲得一個(gè)高效的重組表達(dá)載體——pET-30a-BAFF2，在相同誘導(dǎo)表達(dá)和純化條件下獲得可溶性的BAFF1、BAFF2蛋白，并在體外親和性測(cè)試中獲得較好效果。體外表達(dá)體系構(gòu)建的另一個(gè)重要作用就是為拮抗肽的大規(guī)模生產(chǎn)提供可能，即利用微生物生長周期短、繁殖迅速的特點(diǎn)提高產(chǎn)量、降低成本，而如何保持重組體系的高效穩(wěn)定則是需要迫切解決的問題。

2 細(xì)胞因子拮抗肽的作用機(jī)理

2.1 拮抗肽與靶細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合 拮抗肽發(fā)揮功能的關(guān)鍵主要在于其特殊的肽鏈及高級(jí)空間結(jié)構(gòu)，可通過促進(jìn)拮抗肽與靶細(xì)胞的受體特異性結(jié)合而競爭性或非競爭性抑制細(xì)胞因子與受體的結(jié)合。研究者將多肽類抗腫瘤擴(kuò)散抑制劑與細(xì)胞表面的整合素、層粘連蛋白(LN)和纖維粘連蛋白(FN)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，通過飽和上述位點(diǎn)可抑制細(xì)胞因子所致腫瘤黏附、浸潤和轉(zhuǎn)移(RGD短肽)，抑制腫瘤細(xì)胞黏附到內(nèi)皮細(xì)胞并降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力(GRGDS短肽)。設(shè)計(jì)合成拮抗肽過程中，其與受體細(xì)胞的親和能力是最重要的因素。錢鈺等［19］認(rèn)為，TNF拮抗治療中細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路涉及物理作用、磷酸化、泛素化、酶復(fù)合作用等多個(gè)過程，構(gòu)建拮抗肽時(shí)需要選擇特定的化學(xué)基團(tuán)(氨基酸基團(tuán)、殘基)提高與靶向目標(biāo)(可以是中間信號(hào)分子)的親和能力、更好的阻斷信號(hào)通路。在噬菌體肽庫的短肽鏈篩選上，也需要從靶細(xì)胞出發(fā)選擇結(jié)合性能最好的拮抗肽。

2.2 拮抗肽模擬受體元件與細(xì)胞因子結(jié)合 除與細(xì)胞受體特異性結(jié)合外，部分小分子拮抗肽尚可模擬細(xì)胞靶受體的功能元件與細(xì)胞因子結(jié)合進(jìn)而阻止細(xì)胞因子與靶受體的結(jié)合，抑制相應(yīng)信號(hào)通路的傳遞。Gevaert等［20］研究發(fā)現(xiàn)，IL-5的某種拮抗肽具有與其相似的二硫鍵交聯(lián)結(jié)構(gòu)，可模擬結(jié)合位點(diǎn)而阻斷原信號(hào)通路。Bourboulia等［21］發(fā)現(xiàn)，CD147拮抗肽(HAb18G等)可在高位阻斷細(xì)胞因子的分泌進(jìn)而抑制其促基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)生成作用，最終抑制腫瘤擴(kuò)散。陳麗娜等發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞內(nèi)有一種TNF的天然小分子模擬肽拮抗劑，其產(chǎn)生于跨膜運(yùn)輸后的酶切脫落或mRNA剪切異常，可作為負(fù)調(diào)節(jié)因子將細(xì)胞因子轉(zhuǎn)運(yùn)至各種組織細(xì)胞釋放(或者延緩釋放)，從而阻斷細(xì)胞因子與細(xì)胞靶受體的結(jié)合，抑制信號(hào)通路的發(fā)生。此類拮抗肽的特點(diǎn)為天然無抗原性、無排異性。

2.3 大分子拮抗肽的抑制作用 錢鈺等［19］發(fā)現(xiàn)，某些大分子拮抗肽可通過氨基酸殘基的直接酸堿中和作用或底物磷酸化某些信號(hào)分子等宏觀反應(yīng)抑制細(xì)胞因子。王聰?shù)龋?2］研究表明，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的拮抗肽P7與bFGF結(jié)合后，bFGF激活的促增殖信號(hào)分子磷酸化水平降低、細(xì)胞增殖作用受抑。此類拮抗肽相對(duì)分子質(zhì)量較大，關(guān)鍵結(jié)構(gòu)是一些有快速反應(yīng)能力的氨基酸殘基或其功能基團(tuán)，可通過分離機(jī)體組織液獲取。Gautier等［23］通過核磁共振(NMR)和細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VEGF的拮抗肽化合物能抑制VEGF165誘導(dǎo)的VEGFR-1磷酸化，有望作為新的抗血管生成劑用于臨床。

拮抗肽的作用機(jī)理與肽鏈的一級(jí)乃至二、三、四級(jí)空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。選擇合適的靶點(diǎn)目標(biāo)及利用結(jié)構(gòu)解析深化作用機(jī)理研究相互構(gòu)效的關(guān)系，有望實(shí)現(xiàn)功能肽鏈的不斷改進(jìn)。

3 細(xì)胞因子拮抗肽在臨床上的應(yīng)用

3.1 TNF-α拮抗肽 TNF-α是細(xì)菌性膿毒血癥病理機(jī)制中的關(guān)鍵介質(zhì)，其過量表達(dá)在RA、感染性休克及其他多種炎癥反應(yīng)過程中均具有損傷性、甚至致死性。早期研究［24］顯示，細(xì)胞因子在RA發(fā)病中具有一定作用，且患者關(guān)節(jié)滑液中可檢測(cè)到IL-1、TNF、IL-6、IL-2、粒細(xì)胞集落刺激生物因子(GMCSF)等主要炎性細(xì)胞因子。另有學(xué)者［25，26］報(bào)道，利用匹配篩選出的高親和力特異性單克隆抗體可以較好的中和人TNF等因子(包括A2抗體、降低免疫原性后的cA2嵌合型抗體)，從而較好的控制TNF異常表達(dá)誘發(fā)的疾病。歐洲四個(gè)地區(qū)的雙盲、隨機(jī)、安慰劑對(duì)照試驗(yàn)顯示，應(yīng)用1、10 mg/kg的cA2后兩組有效率分別為44%、79%，之后的二期臨床進(jìn)一步篩選了用量及周期［24］。

3.2 IL拮抗肽 IL-1α、IL-β 都屬于重要的 IL，在炎癥反應(yīng)中起調(diào)節(jié)劑的作用，其大量產(chǎn)生會(huì)引起下列內(nèi)分泌效應(yīng):誘導(dǎo)肝臟急性期蛋白合成;引起發(fā)熱和惡病質(zhì)。通常機(jī)體能夠通過自身分泌受體拮抗肽IL-1ra調(diào)節(jié)IL-1r的結(jié)合通量和活性。Akeson等［27］利用人工重組可溶性IL-1受體篩選15肽噬菌體肽庫，得到的特異性短肽鏈活性接近天然IL-1ra;進(jìn)一步設(shè)計(jì)構(gòu)建得到15肽鏈AF12198，在機(jī)體內(nèi)外均可抑制多種IL-1誘導(dǎo)的生物學(xué)活性。IL-5通常由抗原活化的CD+4T細(xì)胞產(chǎn)生，主要功能是刺激嗜酸性粒細(xì)胞增殖、分化及活化。在過敏性疾病和蠕蟲感染時(shí)機(jī)體出現(xiàn)的嗜酸性粒細(xì)胞驟增也主要經(jīng)由IL-5引起，特別是人類體內(nèi)的IL-5還能刺激嗜堿性粒細(xì)胞釋放白三烯和組胺等炎癥介質(zhì)，提高嗜堿性粒細(xì)胞的生理活性。England等［28］進(jìn)行隨機(jī)肽庫篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，將人體IL-5 Ra胞外區(qū)(ECD)作為靶點(diǎn)可以匹配到兩種能與之特異性結(jié)合的小分子肽，其后創(chuàng)立變構(gòu)肽庫時(shí)通過親和性篩選獲得具有拮抗IL-5功能的19肽AF18748，而嗜酸粒細(xì)胞黏附試驗(yàn)顯示目標(biāo)肽鏈可高效拮抗IL-5的生理活性。

3.3 BAFF拮抗肽 BAFF屬于腫瘤壞死因子配體超家族(TNSF)，其功能主要是刺激B細(xì)胞增殖、分化和成熟并維持其生理活性，在體液免疫應(yīng)答過程中具有不可替代的作用。正常機(jī)體環(huán)境中，TACI、B細(xì)胞成熟抗原(BCMA)、BR3三個(gè)自身受體可與BAFF特異性結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)B細(xì)胞生理活性并維持機(jī)體免疫應(yīng)答平衡。BAFF分泌不足會(huì)引起機(jī)體免疫功能紊亂、低下，造成免疫缺陷類疾病;BAFF表達(dá)過度則會(huì)誘發(fā)B細(xì)胞的惡性增殖、引起B(yǎng)細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)性疾病如RA、干燥綜合征(SS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和 B淋巴細(xì)胞瘤等［29］。Kayagaki等［30］研究表明，以 BR3 和 BCMA為基本構(gòu)象的拮抗肽可高效抑制BAFF的生理功能，而利用BAFF及短肽鏈的3D結(jié)構(gòu)分析可以定向設(shè)計(jì)、構(gòu)建具有拮抗功能的拮抗肽，并可通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其用于臨床治療的可行性。研究者在TACI關(guān)鍵氨基酸殘基的基礎(chǔ)上自行設(shè)計(jì)并合成得到兩種拮抗肽TA和TC，其抑制率隨肽濃度增大而顯著增高，拮抗肽質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)對(duì)目標(biāo)BAFF的抑制率分別達(dá)31%和51%，有著良好應(yīng)用前景。

3.4 癥狀緩解類拮抗肽 部分免疫類疾病致病機(jī)理復(fù)雜，但引發(fā)癥狀較嚴(yán)重。如強(qiáng)直性脊柱炎(AS)發(fā)病早期隱匿性高、致病過程長，最終導(dǎo)致患者正?；顒?dòng)能力喪失。能高效、低毒迅速緩解AS的癥狀，又能選擇性有效阻斷AS病理過程的治療方法是目前所推崇的。Santos等［31］研究表明，HLA-B27是AS發(fā)病免疫過程的中心環(huán)節(jié);有學(xué)者將HLA-B*2704及HLA-B*2705重鏈胞外區(qū)蛋白作為釣餌篩選噬菌體12肽隨機(jī)肽庫，獲得了能與其特異性結(jié)合的小分子拮抗肽，以此為基礎(chǔ)加工構(gòu)建了具有治療功效的拮抗肽分子，并在體外功能鑒定中獲得較好效果。

以上幾種是較為典型的細(xì)胞因子拮抗肽在臨床醫(yī)療或?qū)嶒?yàn)階段的應(yīng)用，都表現(xiàn)出高效、特異的優(yōu)點(diǎn)，隨著拮抗肽作用機(jī)理研究的深化以及拮抗肽合成方式的優(yōu)化，這種治療方法有望得到更大規(guī)模的推廣。

細(xì)胞因子造成的免疫類疾病長期以來給人們的健康造成了非常大的危害，而拮抗肽是可以特異性治療此類疾病的藥物，對(duì)其功效以及機(jī)理的研究有著非常大的實(shí)用價(jià)值。目前已經(jīng)研發(fā)了可有效控制RA、癌細(xì)胞擴(kuò)散及AS的多種拮抗肽類制劑，對(duì)其機(jī)理的研究也已經(jīng)從功能作用深入到分子結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)效上，故其擴(kuò)大應(yīng)用的前景十分可觀。今后的研究需要掌握拮抗肽對(duì)機(jī)體穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的影響，在分子水平更深入解析不同部位的作用及整體構(gòu)象的影響，在合成方法和工藝上需要從天然獲取角度開發(fā)新的思路。

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