類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血漿Ghrelin水平變化及其基因C408A多態(tài)性分析

楊梅花，王向紅，馮忠軍，米 嬌，張志紅

(1石家莊市第一醫(yī)院，石家莊050000;2石家莊市第六醫(yī)院;3河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院)

Ghrelin是1999年日本科學(xué)家Kojima從大鼠胃中分離出來(lái)的一種活性多肽，含28個(gè)氨基酸，是促進(jìn)生長(zhǎng)激素受體活性的內(nèi)源性配體，故又稱生長(zhǎng)激素［1］。近年研究［2］發(fā)現(xiàn)，Ghrelin 能促進(jìn)生長(zhǎng)激素釋放，且具有抑制炎癥因子釋放、降低血壓、增進(jìn)食欲、促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)糖代謝等作用。本研究觀察了120例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者血漿Ghrelin水平并分析了其基因C408A(Leu72Met)多態(tài)性，旨在探討Ghrelin在RA發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年1月～2010年12月河北省人民醫(yī)院、河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院、石家莊市第一醫(yī)院RA患者120例(RA組)，男46例，女74例;年齡27～79歲，均為漢族。均符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)和2009年ACR/EULAR制定的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，病程為1～28 a，RA疾病活動(dòng)性評(píng)分系統(tǒng)(DAS28)評(píng)分為(3.7±1.14)分;均無(wú)其他自身免疫性疾病及傳染病。選擇健康體檢者150例為對(duì)照組，男64例，女85例;年齡21～70歲，均為漢族。兩組年齡、性別具有可比性。研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)石家莊市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2 血漿Ghrelin檢測(cè) 兩組均抽取空腹靜脈血5 mL，其中2 mL采用ELISA法測(cè)定血漿Ghrelin水平，檢測(cè)試劑盒由上海蘭基生物有限公司提供，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作;余3 mL以樹(shù)脂法提取DNA，保存于-70℃冰箱用于下述實(shí)驗(yàn)。

1.3 Ghrelin基因C408A位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè) 采用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法。查閱相關(guān)文獻(xiàn)及與GenBank核對(duì)序列設(shè)計(jì)引物，上游引物序列5'-GCTGGGCTCCTACCTGAGC-3'，下游引物序列5'-GGACCCTGTTCACTGCCAC-3'(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成)。以50 ng/μL的 DNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 5 min，變性94℃ 45 s，退火61℃45 s，延伸72℃ 45 s，循環(huán)30次;末端延伸72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠確認(rèn)后，繼以BsrI限制性內(nèi)切酶(Fermentas公司)酶切，65℃水浴保溫4 h，于2%瓊脂糖凝膠上100 V/cm電泳30 min，紫外燈下觀測(cè)基因型。利用凝膠成像系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果、觀測(cè)基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算Hardy Weinberg平衡以判斷樣本的代表性。計(jì)量資料以±s表示，組間比較用SNK檢驗(yàn)及單因素方差分析(One-way ANOVA)。構(gòu)成比的比較用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿Ghrelin水平 RA組和對(duì)照組血漿Ghrelin 分別為(115.03 ±38.12)、(156.28 ±65.84)pg/mL，組間比較，P ＜0.05(F=27.531)。

2.2 Ghrelin基因型和等位基因頻率分布 兩組Ghrelin基因型和等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，具有群體代表性。Ghrelin基因C408A存在堿基二態(tài)性C或A，對(duì)照組基因型為 AA 型1.4%、CA 型 27.3%、CC 型 71.3%，等位基因的頻率分布A為15.0%、C為85.0%，攜帶突變基因CA+AA的頻率為28.7%;RA組為AA型2.5%、CA 型 38.3%、CC 型 59.2%，基因頻數(shù)分布A為21.7%、C為78.3%，攜帶突變基因 CA+AA的頻率為40.8%。兩組基因型和等位基因頻率比較均有顯著差異，P 均 ＜0.05(χ2=6.317)。

2.3 RA組Ghrelin基因型與血漿Ghrelin水平、病程、DAS28評(píng)分的關(guān)系 基因型為CC、CA、AA者血漿 Ghrelin 分別為(167.42 ±53.7)、(124.66 ±47.3)、(93.41 ± 11.5)pg/mL，三者比較，P ＜ 0.05(F=26.414);平均病程分別為 1.7、5.8、5.2 a，三者比較，P ＜0.05(F=28.983);DAS28 評(píng)分分別為(3.48 ±1.21)、(3.95 ±1.16)、(3.82 ±1.03)分，三者比較，P ＞0.05(F=4.921)。

3 討論

RA是一種慢性全身性炎癥，其發(fā)病病因與機(jī)制尚未完全清楚，主要臨床表現(xiàn)為多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變，呈慢性、對(duì)稱性病變。RA屬于自身免疫炎性疾病，免疫復(fù)合物和類風(fēng)濕因子是造成關(guān)節(jié)發(fā)生病變的重要因素之一。目前認(rèn)為RA是環(huán)境因素與遺傳因素共同作用的結(jié)果，而且很多炎癥因子如IL-17、腫瘤壞死因子(TNF)、IL-6及血管內(nèi)皮生生長(zhǎng)因子等在發(fā)病中起重要作用［3，4］。Ghrelin能促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖、抑制炎性反應(yīng)因子釋放，在炎性反應(yīng)中扮演重要角色;還能抑制T細(xì)胞，使細(xì)胞被炎性反應(yīng)激活、mRNA 表達(dá)明顯升高［4］;抑制 TNF-χ誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)mRNA 表述［5，6］。Ghrelin的單核苷酸基因多態(tài)性與血漿Ghrelin水平的關(guān)系存在爭(zhēng)議，但前者可影響外周血液細(xì)胞中Ghrelin基因的mRNA表達(dá)，說(shuō)明在免疫微環(huán)境的影響下Ghrelin很可能存在一個(gè)自分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)。三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎急性期小鼠Ghrelin及其受體mRNA表達(dá)明顯增高［7］，在抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(ANCA)相關(guān)的血管炎、炎癥性直腸炎等急性炎癥期 Ghrelin 的 mRNA 表達(dá)亦增加［8，9］。本研究顯示，RA組血漿Ghrelin水平顯著低于對(duì)照組。提示Ghrelin可能參與了RA的發(fā)生、發(fā)展。

文獻(xiàn)［10］報(bào)道，甘肅地區(qū)回族人群 CC、CA、AA基因型比例分別為 70.8%、26.5%、2.7%。本研究進(jìn)行的Ghrelin基因C408A多態(tài)性檢測(cè)顯示，兩組共發(fā)現(xiàn)87例雜合子、5例純合子、178例野生型，且組間基因型和基因頻率比較均有顯著差異。提示河北地區(qū)人群存在該位點(diǎn)變異，但基因型分布與上述文獻(xiàn)報(bào)道無(wú)顯著差異;CA型與純合AA型均可增加RA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)?？赡軝C(jī)制為基因多態(tài)性由突變遺傳所致，但河北地區(qū)與甘肅地域相距較近。有研究［11］顯示，Ghrelin基因Arg51Gln位點(diǎn)多態(tài)性者血漿Ghrelin水平較低，而C408A位點(diǎn)多態(tài)性者血漿Ghrelin水平較高。亦有研究證實(shí)，C408A和Gln90Leu兩種Ghrelin多態(tài)性基因并不影響血漿Ghrelin水平［12］。本研究顯示，RA組不同基因型者血漿Ghrelin水平及病程存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明Ghrelin基因C408A多態(tài)性可能影響RA患者血漿Ghrelin水平及RA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，其中CA型和AA型可能與，RA病程延長(zhǎng)有關(guān)。推測(cè)各研究結(jié)果不同的原因很可能是血漿Ghrelin水平主要與營(yíng)養(yǎng)狀況有關(guān)。有研究［13］表明 Ghrelin基因A-501C多態(tài)性可增加RA的患病風(fēng)險(xiǎn)，但是并不會(huì)對(duì)RA的病情嚴(yán)重程度產(chǎn)生影響。本研究顯示RA組不同基因型者DAS28評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與上述文獻(xiàn)一致。提示Ghrelin基因C408A多態(tài)性引起的Ghrelin血漿水平降低、發(fā)病提前及病程延長(zhǎng)很可能與影響Ghrelin的正常功能及Ghrelin的mRNA表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致Ghrelin抗炎作用降低、RA相關(guān)致病炎性因子對(duì)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)破壞有關(guān)。

綜上所述，RA患者存在血漿Ghrelin水平降低及Ghrelin基因C408A位點(diǎn)變異，純合的AA型和雜合的CA型均可比野生的CC型增加RA患病風(fēng)險(xiǎn)增加，但Ghrelin基因可能并非河北漢族RA的主效基因。

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