三七總皂苷保護(hù)腦缺血再灌注腦損傷機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

王海芳

（山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2011級(jí)中五一班，山東濟(jì)南250355）

三七總皂苷（totalsaponins of panax notognseng，PNS）是從三七中提取的有效活性成分，具有減小腦梗死體積、降血脂、改善血腦屏障通透性、清除自由基、抗炎、抗氧化等作用［1］。近年來，對(duì)腦缺血再灌注損傷后PNS的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行了大量研究，本文就PNS保護(hù)腦缺血再灌注腦損傷機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行綜述。

1 抑制炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）是主要的致炎因子。TNF-α在腦缺血損傷中起雙重作用，少量的TNF-α對(duì)腦缺血損傷起修復(fù)和保護(hù)作用，過量的TNF-α可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。正常情況下，腦內(nèi)僅有少量TNF-α表達(dá)，腦缺血再灌注6 h后TNF-α表達(dá)增強(qiáng)，48 h后表達(dá)最明顯，提示TNF-α異常表達(dá)與腦缺血再灌注損傷有關(guān)。PNS可顯著抑制腦缺血再灌注后不同時(shí)期內(nèi)TNF-α的表達(dá)，從而減輕腦缺血后TNF-α介導(dǎo)的一系列損傷，減少神經(jīng)元凋亡的發(fā)生［2］。

IL-1也是重要的炎癥反應(yīng)因子，其中起主要作用的是IL-1β。IL-1β主要通過與IL-1RⅠ結(jié)合誘導(dǎo)白細(xì)胞黏附，介導(dǎo)白細(xì)胞向缺血腦組織浸潤(rùn)，從而引起腦組織炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血2 h再灌注22 h后，腦組織IL-1β、IL-1RⅠ表達(dá)增高，而PNS可降低腦組織IL-1β和IL-1RⅠ表達(dá)，對(duì)缺血性腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用［3］。

2 抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡

腦缺血再灌注后腦損傷的發(fā)生與一些誘導(dǎo)凋亡的基因過度表達(dá)有關(guān)。Bcl-2基因可抑制過度的細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)腦損傷的作用。研究表明，缺血30 min再灌注24 h后存活腦細(xì)胞中Bcl-2高表達(dá)，表達(dá)主要位于缺血周邊區(qū)［4］，因此認(rèn)為腦缺血再灌注能誘導(dǎo)Bcl-2高表達(dá)，Bcl-2蛋白參與腦缺血再灌注損傷的自我保護(hù)過程。PNS能顯著上調(diào)腦組織內(nèi)Bcl-2的表達(dá)，抑制海馬神經(jīng)元的凋亡，減輕缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞損傷［4-5］。

半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶（caspase）活化后可使一系列細(xì)胞骨架蛋白及細(xì)胞修復(fù)酶等裂解，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［6］。Caspase包括上游調(diào)控其他Caspase活化的 caspase-2，8，9，10 及下游直接介導(dǎo)凋亡的caspase-3，6，7 等［7］。研究表明，腦缺血再灌注后腦內(nèi) caspase-3，8，9表達(dá)增高，經(jīng)PNS治療后caspase-3和caspase-9的表達(dá)降低，而對(duì)caspase-8的表達(dá)無影響，說明PNS可以通過降低caspase-3和caspase-9的表達(dá)而減輕腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡［8-9］。

X-連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）屬于凋亡抑制蛋白家族，它可以直接與caspase結(jié)合，抑制細(xì)胞凋亡［10］。半胱氨酸蛋白酶激活物（second mitochondria-derived activator of caspases，Smac）是一種促凋亡蛋白［11］，可以與 XIAP 的BIR3、BIR2結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，解除其對(duì) caspase-9、caspase-3的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明，缺血再灌注10 h后，腦神經(jīng)元中XIAP蛋白表達(dá)增高，12 h達(dá)到高峰，24 h開始下降，而Smac在再灌注后10 h表達(dá)逐漸增高，高峰出現(xiàn)在再灌注后24 h。免疫組化顯示，經(jīng)PNS治療后XIAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，Smac陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示PNS對(duì)大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與抑制Smac蛋白表達(dá)和促進(jìn)XIAP蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制腦細(xì)胞凋亡有關(guān)［12］。

此外，三七總皂苷抑制腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡，還與抑制JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白激活、抑制線粒體凋亡途徑有關(guān)。

3 抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)

研究表明，氧自由基可氧化細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蛋白和核酸，引起細(xì)胞損傷和凋亡，是引起缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)［13］。體內(nèi)的酶類清除劑，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）等，可以清除氧自由基，減輕自由基引起的脂質(zhì)過氧化損傷。當(dāng)機(jī)體清除氧自由基的能力下降，氧自由基可攻擊細(xì)胞膜，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成丙二醛（MDA）和脂質(zhì)自由基。MDA的含量可以間接反映細(xì)胞損傷的程度。研究表明，經(jīng)PNS治療后缺血再灌注損傷腦組織中MDA含量明顯下降，GSH-PX、SOD活性明顯增高，提示PNS可能通過抑制腦缺血再灌注后的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，起到抗脂質(zhì)過氧化作用［14-15］。另有研究證明，PNS可以降低腦缺血再灌注后腦組織內(nèi)MDA和NO的含量，抑制過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕缺血再灌注后腦組織損傷［16-17］。

4 阻滯細(xì)胞內(nèi)鈣超載

Ca2+是細(xì)胞內(nèi)的第二信使，參與幾乎所有調(diào)控細(xì)胞功能的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。鈣超載是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。鈣調(diào)蛋白（CaM）是細(xì)胞內(nèi)的主要Ca2+受體蛋白，介導(dǎo)Ca2+對(duì)蛋白激酶的刺激。其中CaMKⅡ是Ca2+的重要靶酶，在腦組織含量最高。研究表明，缺血再灌注大鼠海馬及皮層神經(jīng)元CaMKⅡβ mRNA及蛋白表達(dá)顯著增高。經(jīng)PNS治療后，海馬及皮層組織CaMKⅡβ mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低［18］，說明PNS能阻滯腦缺血再灌注后細(xì)胞內(nèi)鈣超載，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。另有研究表明，PNS可降低腦缺血再灌注后海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，抑制線粒體跨膜電位（Δψm）的下降，保護(hù)海馬區(qū)細(xì)胞線粒體功能，發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷［19］。

5 促進(jìn)神經(jīng)再生

神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的增殖、分化可促進(jìn)受損腦組織結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)和重塑［20］，這種作用依賴于多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的協(xié)調(diào)，包括相關(guān)調(diào)節(jié)因子巢蛋白（Nestin）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）和表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等。Nestin 是神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物［21］，Nestin的高表達(dá)提示存在NSCs激活。BNDF是神經(jīng)損傷后，保護(hù)神經(jīng)存活、促進(jìn)再生的必須因子。EGF可誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。腦缺血再灌注后可誘導(dǎo)內(nèi)源性NSCs的自我修復(fù)，但作用有限。PNS在缺血再灌注后1 h、3 h、5 h三個(gè)時(shí)點(diǎn)均可上調(diào)Nestin、BDNF和EGF的表達(dá)，說明PNS可以促進(jìn)受損腦細(xì)胞的增殖和修復(fù)。另有研究表明，PNS可增加缺血腦組織內(nèi)源性BDNF的表達(dá)，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，且與劑量呈正相關(guān)［22］。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是常見的兩種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在缺血性腦損傷中，均有減輕神經(jīng)元損傷的作用。腦缺血后2 h即出現(xiàn)NGF mRNA和bFGF mRNA的表達(dá)，腦缺血程度與NGF和bFGF表達(dá)時(shí)間呈正相關(guān)性，但腦缺血引起的NGF和bFGF產(chǎn)生的時(shí)間短，水平有限，難以發(fā)揮持久的保護(hù)神經(jīng)元的作用。研究表明，PNS可顯著增強(qiáng)缺血后NGF和bFGF的表達(dá)，減輕缺血神經(jīng)元的損傷［23］。

6 改善血腦屏障的通透性

腦缺血后血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）破壞導(dǎo)致血管壁通透性增高，發(fā)生腦水腫。腦缺血后BBB破壞與內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)（endothelial cell matrix，ECM）成分降解和破壞有關(guān)。在腦缺血時(shí)，白細(xì)胞激活、黏附、浸潤(rùn)于血管內(nèi)皮和腦組織，產(chǎn)生大量的蛋白水解酶，包括MMP-2、MMP-9等。MMP-9可以降解血管基底膜，破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接導(dǎo)致血腦屏障破壞。敲除MMP-9基因的小鼠腦梗死體積明顯縮小，血腦屏障破壞程度也顯著減輕［24］。組織金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-1）是機(jī)體內(nèi)存在的MMP-9特異性抑制劑，能抑制MMP-9的活性，阻斷MMP-9對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解［25］。研究表明，PNS可顯著提高腦缺血再灌注后腦組織神經(jīng)元的存活率，減輕腦缺血性損傷，能抑制MMP-9蛋白的表達(dá)，增加TIMP-1蛋白的表達(dá)，提示三七總皂苷可能通過調(diào)節(jié)MMP-9、TIMP-1的表達(dá)而減輕腦水腫［26］。

細(xì)胞因子 IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8 等通過炎癥細(xì)胞的活化，使BBB的通透性增加。研究表明，腦缺血再灌注后上述炎性細(xì)胞因子含量增加，而PNS能降低炎性細(xì)胞因子的含量，降低血腦屏障的通透性，發(fā)揮其改善腦缺血再灌注損傷的作用［27］。

7 改善能量代謝

ATP是腦組織的主要能量來源，可分解為ADP和AMP。腺苷酸池（TAN）水平和能荷值（EC）是衡量機(jī)體、組織和細(xì)胞代謝狀態(tài)的重要參數(shù)，TAN的大小反映了線粒體的氧化呼吸活性和生成高能磷酸化合物的能力，EC是動(dòng)態(tài)反映細(xì)胞能量平衡的一個(gè)參數(shù)［28］，可有效評(píng)估組織細(xì)胞的能量?jī)?chǔ)備狀態(tài)。Na+-K+-ATP酶催化水解ATP釋放磷酸鹽，直接供給自由能，其活性能反映機(jī)體能量代謝水平和生理功能狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注1 h后，腦組織ATP和ADP含量、EC和TAN值顯著下降，Na+-K+-ATP酶活性降低，說明缺血再灌注后腦組織的能量代謝發(fā)生嚴(yán)重障礙，PNS可提高ATP、ADP含量、EC值以及Na+-K+-ATP酶活性。說明PNS可以改善腦缺血再灌注后能力代謝障礙，保護(hù)缺血區(qū)腦細(xì)胞［29］。

綜上所述，PNS可以通過抑制炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載，改善血腦屏障的通透性、能量代謝及促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生等作用，保護(hù)腦缺血再灌注后腦損傷。此外，PNS能延長(zhǎng)大鼠頸總動(dòng)脈血栓形成時(shí)間，降低大鼠血小板聚集率［30］，起到抗血栓作用。PNS對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有效治療時(shí)間窗不超過5 h，超過5 h后無明顯作用，為臨床應(yīng)用PNS制劑（如血塞通等）提供了理論依據(jù)［31］。

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