肉蓯蓉多糖對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦組織膽堿能系統(tǒng)的影響

尹剛，龔道愷，劉幫會(huì)，姚長(zhǎng)江

·基礎(chǔ)研究·

肉蓯蓉多糖對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦組織膽堿能系統(tǒng)的影響

尹剛，龔道愷，劉幫會(huì)，姚長(zhǎng)江

目的：探討肉蓯蓉多糖（CDPS）對(duì)阿爾茨海默?。ˋD）大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織膽堿能系統(tǒng)的影響。方法：60只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、CDPS低劑量組、CDPS中劑量組和CDPS高劑量組，每組10只，后4組采用Aβ1-40側(cè)腦室注射制備AD大鼠模型，CDPS低劑量組、CDPS中劑量組和CDPS高劑量組在制模后分別每天以50、100、200 mg/kg CDPS灌胃，正常對(duì)照組及模型組以等量玉米油灌胃，假手術(shù)組以等量生理鹽水灌胃，均灌胃28 d，進(jìn)行Morris水迷宮檢測(cè)，比色法測(cè)定皮質(zhì)及海馬乙酰膽堿酯酶（AChE）和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）。結(jié)果：CDPS可縮短AD大鼠在Morris水迷宮的潛伏期，增加大腦皮質(zhì)及海馬AChE的含量，提高皮質(zhì)中ChAT的活性。結(jié)論：CDPS可改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與對(duì)膽堿能系統(tǒng)的影響有關(guān)。

肉蓯蓉多糖；阿爾茨海默??；學(xué)習(xí)記憶；膽堿能系統(tǒng)

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是與年齡相關(guān)的進(jìn)行性記憶喪失和高級(jí)認(rèn)知功能減退的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理變化主要表現(xiàn)為細(xì)胞外聚集的β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積形成的老年斑、細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化Tau蛋白所致的神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NFT）,以及前腦基底膽堿能神經(jīng)元的顯著丟失。AD發(fā)病率占65歲以上人群的8%~10%，且正以每5年1倍的速度遞增[1]。AD發(fā)生的確切機(jī)制目前仍未清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為主要是腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)受到損害，并提出了“膽堿能假說(shuō)”：前腦基底膽堿能神經(jīng)元的退變及大腦皮質(zhì)和其他區(qū)域膽堿能遞質(zhì)的缺失是AD患者認(rèn)知失常的主要原因[2]。研究表明，肉蓯蓉的化學(xué)成分包括苯乙醇苷類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、木脂素類(lèi)、多糖和生物堿等，其中多糖是肉蓯蓉的主要活性成分[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，肉蓯蓉具有調(diào)節(jié)免疫、保肝、抗輻射及神經(jīng)保護(hù)等作用[4]。本實(shí)驗(yàn)以Aβ1-40誘導(dǎo)制備AD大鼠模型，給予AD大鼠不同劑量肉蓯蓉多糖（polysacchrides of cistanche deserticola，CDPS）后，觀察大鼠腦組織乙酰膽堿酯酶（acetylcholine esterase，AChE）、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransferase，ChAT）的變化，探討CDPS改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及其對(duì)AD病因干預(yù)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠 60只，體質(zhì)量180~220 g，由華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑 Aβ1-40（購(gòu)于美國(guó)Sigma公司），將1 mg Aβ1-40溶于100 μL無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中，制成5 μg/μL懸浮液，置于37℃恒溫箱中孵育7 d，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的Aβ1-40，置于4℃冰箱備用。ChAT、AchE檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 CDPS的提取[5]肉蓯蓉生藥片1 kg，經(jīng)熱乙醇浸泡3 h后，用紗布過(guò)濾，棄濾液。藥渣加水煎煮3次，每次1～2 h，過(guò)濾，合并濾液（呈棕紅色）。蒸發(fā)濃縮后，離心去沉淀，上清液加2~3倍體積的95%乙醇沉淀，4℃靜置24 h，次日于4℃離心20 min（6 000 r/min）收集沉淀。沉淀經(jīng)水復(fù)溶、脫蛋白透析、冷凍干燥后獲粗多糖（灰棕紅色）。

1.2.2 動(dòng)物分組及模型制備 大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、CDPS低劑量組、CDPS中劑量組和CDPS高劑量組，每組10只。參照文獻(xiàn)制備記憶功能障礙動(dòng)物模型：大鼠腹腔注射水合氯醛（0.35 g/kg）麻醉，固定于腦立體定位儀，頭頂部去毛，消毒皮膚，頭頂部正中切口，暴露前囟，按大鼠腦立位圖譜，于前囟后、中線(xiàn)右側(cè)處，微量注射器自腦表面垂直進(jìn)針，向側(cè)腦室內(nèi)緩慢注入2 μL Aβ1-40留針（假手術(shù)組注射等量生理鹽水），以確保注射溶液充分?jǐn)U散，后緩慢撤針，所有步驟均為無(wú)菌操作，皮膚切開(kāi)處用青霉素抗菌，縫合傷口。CDPS低劑量組、CDPS中劑量組和CDPS高劑量組在模型制備后分別每天以低劑量（50 mg/kg）、中劑量（100 mg/kg）、高劑量（200 mg/kg）CDPS灌胃，正常對(duì)照組及模型組以等量玉米油灌胃，假手術(shù)組以等量生理鹽水灌胃，連續(xù)28 d。

1.2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分別于術(shù)前7 d、術(shù)后7 d和術(shù)后28 d進(jìn)行。測(cè)試主要完成定位航行試驗(yàn)，前2 d為適應(yīng)期，每天上、下午分別進(jìn)行2次，訓(xùn)練時(shí)依次將大鼠按順時(shí)針?lè)较蛴?個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄大鼠找到并爬上平臺(tái)所需的時(shí)間，即逃避潛伏期（escape latensy，EL）。如果大鼠找到平臺(tái)時(shí)間≤1 min，記錄其實(shí)際EL；如果找到平臺(tái)時(shí)間＞1 min，則由操作者將其引上平臺(tái)并停留15 s，EL記錄為1 min。

1.2.4 大鼠皮質(zhì)海馬組織ChAT及AchE活性測(cè)定 水迷宮實(shí)驗(yàn)完畢后，將大鼠頸椎脫臼法處死后取腦，分離出皮質(zhì)和海馬，稱(chēng)重后迅速置于－20℃冰箱中冷凍，加入預(yù)冷的生理鹽水，冰浴制成10%勻漿。ChAT測(cè)定是以乙酰輔酶和膽堿為底物，在ChAT的作用下，反應(yīng)的生成物和顯色劑結(jié)合，在324 nm處測(cè)定吸光度，以此計(jì)算ChAT的活力，具體操作按照測(cè)定試劑盒進(jìn)行。AchE水解乙酰膽堿生成膽堿及乙酸，膽堿可與巰基顯色劑反應(yīng)生成對(duì)稱(chēng)三硝基苯黃色化合物，根據(jù)顏色深淺進(jìn)行比色定量，水解產(chǎn)物膽堿的數(shù)量可反應(yīng)膽堿酯酶的活力，具體操作按照測(cè)定試劑盒進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CDPS對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

2.2 CDPS對(duì)大鼠海馬和皮質(zhì)組織AchE和ChAT活性的影響

在皮質(zhì)和海馬組織，與假手術(shù)組相比，模型組AchE活力升高，ChAT活力降低（<0.05），說(shuō)明Aβ1-40對(duì)大鼠皮質(zhì)和海馬組織的AchE和ChAT有損害作用。CDPS能顯著提高海馬組織ChAT活性（<0.01）。CDPS可顯著抑制海馬組織的AchE活力（<0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠EL、AchE和ChAT活性比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，①<0.01；與假手術(shù)組比較，②<0.01；與模型組比較，③<0.01；與術(shù)后7 d比較，④<0.01；與假手術(shù)組比較，⑤<0.05

正常對(duì)照組 10 17.69±0.84 16.41±0.94 16.57±0.69 2.28±0.21 8.96±1.10假手術(shù)組 10 17.43±0.83 16.82±0.61 16.92±0.38 2.16±0.18 8.65±1.15模型組 10 18.15±0.65 46.18±1.04①② 45.52±0.93①② 1.23±0.14⑤ 3.65±0.68⑤CDPS低劑量組 10 18.44±0.45 44.64±1.53①② 25.39±1.22③④ 1.89±0.22③ 5.63±0.43③CDPS中劑量組 10 18.23±0.23 48.35±1.41①② 19.32±0.81③④ 2.45±0.41③ 7.86±0.61③CDPS高劑量組 10 17.43±0.36 46.21±1.52①② 15.42±0.19③④ 3.21±0.22③ 8.82±0.59③

3 討論

AD發(fā)病的膽堿能假說(shuō)認(rèn)為，出現(xiàn)AD的病理過(guò)程時(shí)大腦基底前腦膽堿能神經(jīng)元發(fā)生退行性病變，ChAT和AchE的活性改變，引起ACh的運(yùn)輸合成翻譯攝取減少，導(dǎo)致學(xué)習(xí)與記憶力衰退[6]。研究表明AD患者腦內(nèi)ACh合成分泌減少，其合成酶ChAT活性下降，且與癡呆嚴(yán)重程度密切相關(guān)，海馬和皮質(zhì)錐體細(xì)胞的突觸、突觸煙堿受體及突觸前M受體均減少[7]，故學(xué)習(xí)記憶力降低與膽堿能功能紊亂關(guān)系最為密切。

本實(shí)驗(yàn)選用側(cè)腦室立體定位儀注射Aβ1-40制作AD動(dòng)物模型，結(jié)果提示側(cè)腦室注射凝聚態(tài)Aβ1-40 7 d后大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能下降。崔麗霞等[8]報(bào)道側(cè)腦室立體定位儀注射Aβ1-40大鼠第5天的EL明顯延長(zhǎng)、跨臺(tái)次數(shù)明顯減少，可見(jiàn)雙側(cè)側(cè)腦室注射Aβ1-40均可使大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在水迷宮實(shí)驗(yàn)中CDPS可明顯降低大鼠EL，縮短到達(dá)平臺(tái)時(shí)間，結(jié)果提示CDPS可改善大鼠認(rèn)知功能。研究中發(fā)現(xiàn)大鼠側(cè)腦室注射Aβ1-40后，皮質(zhì)和海馬組織ChAT降低，符合AD病理特征。CDPS能明顯改善大鼠海馬組織的ChAT活力，能抑制皮質(zhì)和海馬組織的AchE。

Ach是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，膽堿能系統(tǒng)對(duì)于機(jī)體正常的認(rèn)知功能發(fā)揮著重要功能。Ach在皮質(zhì)和海馬的缺失將導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知功能顯著降低[9]。海馬是大腦完成學(xué)習(xí)記憶最重要的部位，在空間記憶的獲得儲(chǔ)存提取中發(fā)揮重要作 用[10]。研究發(fā)現(xiàn)增加認(rèn)知障礙患者海馬Ach濃度后，認(rèn)知和空間記憶功能均得到改善[11]。Ach合成的關(guān)鍵酶是ChAT，主要合成場(chǎng)所在膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞體，ChAT活性直接體現(xiàn)大腦膽堿能系統(tǒng)功能，ChAT活性提高可提高神經(jīng)元面積和認(rèn)知功能[12]。AchE可加快軸突生長(zhǎng)，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞相互作用，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，改善多巴胺能神經(jīng)元功能，促進(jìn)β淀粉樣肽沉淀形成[13]。CDPS不僅提高ChAT活性，還可減低AchE活性，顯示其可能通過(guò)增加腦內(nèi)Ach活性抑制Aβ1-40導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙。

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（本文編輯：唐穎馨）

R741;R741.05

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.05.023

長(zhǎng)江大學(xué)荊州臨床醫(yī)學(xué)院荊州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科湖北荊州434020

湖北省教育廳優(yōu)秀中青年人才項(xiàng)目（No.Q20101316）

2014-01-18

尹剛7706190@163.com