頭孢曲松鈉抗慢性神經(jīng)病理性痛的作用機制研究

盧麗莉 楊倩 仇艷玲

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與脊髓水平傷害性信息的傳遞及痛覺過敏的形成［1］。由于胞外沒有谷氨酸的代謝酶，胞外谷氨酸的清除主要依靠谷氨酸轉(zhuǎn)運體［2］。目前已克隆出五種高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運體 GLAST(EAAT1)、GLT-1(EAAT2)、EAAC1(EAAT3)、EAAT4 和 EAAT5。研究表明，GLT-1在病理性痛和痛過敏的發(fā)生和維持中發(fā)揮重要作用［2］。2005 年 Rothstein 等［3］報道，β-內(nèi)酰胺類抗生素(包括青霉素和一些新的衍生物)具有新的功能，其中頭孢曲松(Ceftriaxone，Cef)可增加GLT-1的表達和谷氨酸的攝取。但β-內(nèi)酰胺類抗生素是否會對慢性神經(jīng)病性疼痛過程產(chǎn)生影響尚未報道。本研究觀察β-內(nèi)酰胺類抗生素Cef對CCI大鼠慢性神經(jīng)病理性痛過敏的影響，為臨床上病理性痛的防治提供新線索與思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只，體重(280±20)g，將動物隨機分組:Sham組(n=10):僅暴露坐骨神經(jīng)不進行結(jié)扎;CCI組(n=10):行右側(cè)CCI;Cef治療(Cef therapy)組(n=10):于CCI手術(shù)后第7天開始腹腔注射Cef，1次/d，共注射7次。于術(shù)前1 天，術(shù)后第 1、3、5、7、9、11、14 天測定熱縮足反射潛伏期、機械縮足反射閾值。Cef預防(Cef prevention)組(n=10):于CCI手術(shù)后當天開始腹腔注射Cef，1次/d，共注射7次。于CCI術(shù)前1 d，術(shù)后第1、3、5、7天觀察熱縮足反射潛伏期、機械縮足反射閾值的變化。Cef預防(Cef prevention)組、Cef治療(Cef therapy)組以相同程序腹腔注射0.9%氯化鈉溶液作為對照(NS control)組。

1.2 慢性神經(jīng)痛模型(CCI)的建立 參照Bennett等［4］的方法制作 CCI模型。大鼠稱重后腹腔注射(intraperitoneal injection)10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，取側(cè)臥位放置。無菌條件下切開右下肢股部皮膚，鈍性分離肌肉組織，暴露并輕柔分離坐骨神經(jīng)，于坐骨神經(jīng)分成三支前的主干部位處用4-0鉻制羊腸線松扎四道，間距為1～2 mm，結(jié)扎線的松緊以保證神經(jīng)的一周均受壓，但不影響神經(jīng)外膜的血運為度。結(jié)扎時應引起小腿肌肉輕度顫動。逐層縫合切口，對側(cè)下肢肌內(nèi)注射慶大霉素(0.2 ml，10 mg/ml)預防感染。Sham組大鼠僅暴右側(cè)坐骨神經(jīng)但不結(jié)扎。

1.3 熱縮足反射潛伏期的測定 應用BME-410A型熱痛刺激儀(光源為12 V/35 W鹵素燈)進行。測痛實驗臺高36 cm，頂部為2 mm厚的石英玻璃板，將有機玻璃板制成的動物籠(220 mm×220 mm×280 mm，無底，用有機玻璃隔板隔成3個23 cm×11 cm×28 cm的獨立空間)置于測痛實驗臺頂部的石英玻璃板上，將待測動物置于籠內(nèi)，調(diào)節(jié)光源與石英玻璃板之間的距離，使落在足底的照射光圈直徑5 mm，記錄從開始照射至出現(xiàn)縮足逃避反射的時間(s)，作為熱刺激縮足潛伏期。重復測量5次，同一部位間隔10 min，不同部位間隔5 min，取平均值作為統(tǒng)計數(shù)值。如＞30 s無反應則停止照射，以免導致大鼠足底組織過熱損傷。

1.4 機械縮足反射閾值測定 應用von-Frey纖維機械刺激器進行，該刺激器包括12個不同的刺激強度，分別為 0.09、0.18、0.28、0.52、1.12、3.8、5.5、7.7、10.4、18.2、44 和 61 g。將透明有機玻璃動物籠(規(guī)格同上)置于頂部為鐵絲網(wǎng)36 cm高的測痛實驗臺上，將待測大鼠置于籠中。實驗者手持von-Frey纖維穿過鐵絲網(wǎng)格分別刺激大鼠兩側(cè)足底中心部位，刺激強度由小到大，每個強度反復刺激10次(次與次的間隔3～5 s)，將出現(xiàn)縮足反應5次以上的強度定為大鼠對機械刺激的反應閾值。如以61 g von-Frey纖維刺激大鼠足底不出現(xiàn)縮足反射，則認為大鼠痛反應遲鈍，均以61 g計;機械刺激閾值＜0.09 g者均以0.09 g計。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間應用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組內(nèi)應用配對t檢驗(paried t-test)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 熱縮足反射潛伏期 Sham組大鼠手術(shù)側(cè)后肢熱縮足反射潛伏期在所觀測的14 d內(nèi)均無明顯的變化。CCI組大鼠CCI前熱縮足反射潛伏期在14 s左右，于CCI后第3天大鼠CCI側(cè)后肢熱縮足反射潛伏期開始下降，與Sham組比較明顯縮短(P＜0.05)。術(shù)后第5～7天下降到基礎值的55%左右，達最低值，一直持續(xù)到所測試的第14天。對照組CCI側(cè)后肢熱縮足反射潛伏期與CCI組比較未見明顯變化，而Cef預防組大鼠CCI側(cè)后肢熱縮足反射潛伏期于CCI后第5天、第7天同對照組比較明顯延長(P＜0.05)。Cef治療組CCI側(cè)后肢熱縮足反射潛伏期在術(shù)后第11天、第14天與對照組比較明顯延長(P＜0.05)。見表1、圖1。

表1 6組大鼠熱縮足潛伏期n=10，s，±s

表1 6組大鼠熱縮足潛伏期n=10，s，±s

注:與CCI組比較，*P ＜0.05;與術(shù)后立即注射0.9%氯化溶液比較，#P ＜0.05;與第7天開始注射0.9%氯化鈉溶液比較，△P ＜0.05

結(jié)扎天數(shù) Sham組 CCI組 術(shù)后立即注射0.9%氯化鈉溶液 Cef預防組 第7天開始注射0.9%氯化鈉溶液 Cef 治療組正常 15.2 ±1.8 14.0 ±0.9 14.11 ±0.71 14.4 ±1.2 14.3 ±1.4 14.0 ±1.1術(shù)后第1 天 14.0 ±1.1 14.2 ±0.7 14.58 ±0.45 14.6 ±1.1 14.2 ±0.8 13.7 ±1.0術(shù)后第3 天 15.4 ±0.8* 9.5 ±1.4 9.83 ±0.23 9.2 ±1.0 8.5 ±0.8 9.5 ±0.6術(shù)后第5 天 14.6 ±1.4* 6.6 ±1.2 7.14 ±1.91 9.6 ±0.5# 5.8 ±0.7 6.9 ±1.6術(shù)后第7 天 13.5 ±1.6* 7.5 ±1.1 6.92 ±0.66 12.3 ±1.7# 7.2 ±1.3 7.6 ±1.9術(shù)后第9天 13.7±0.8* 7.4±1.7 － － 6.5±1.6 7.7±0.4術(shù)后第11天 14.5±1.7* 7.2±1.0 － － 6.7±0.3 10.3±0.7△術(shù)后第14天 13.8±1.2* 7.7±1.7 － － 6.6±1.1 12.1±1.0△

圖1 CCI后熱縮足反射潛伏期的變化和腹腔注射Cef及0.9%氯化鈉溶液后對CCI后熱縮足反射潛伏期的影響

2.2 機械縮足反射閾值 Sham組大鼠手術(shù)側(cè)后肢機械縮足反射閾值在所觀測的14 d內(nèi)無明顯的變化。CCI 14天組大鼠術(shù)前機械縮足反射閾值維持在34.0 g左右，于CCI后第3天CCI側(cè)后肢機械縮足反射閾值開始下降，與Sham組相比有明顯降低(P＜0.05)。術(shù)后第5～7天機械縮足反射閾值下降到基礎值的20%左右，持續(xù)到所測試的第14天。對照組CCI側(cè)后肢機械縮足反射閾值與CCI組相比未見明顯變化，Cef預防組，CCI側(cè)后肢機械縮足反射閾值在術(shù)后第7天同對照組相比明顯升高(P＜0.05)。Cef治療組CCI側(cè)后肢機械縮足反射閾值在術(shù)后第14天同對照組相比明顯升高(P＜0.05)。見表2、圖2。

表2 大鼠機械縮足反射閾值n=10，g，±s

表2 大鼠機械縮足反射閾值n=10，g，±s

注:CCI組比較，*P ＜0.05;與術(shù)后立即注射0.9%氯化鈉溶液比較，#P ＜0.05;與第7天開始注射0.9%氯化鈉溶液比較，△P ＜0.05

結(jié)扎天數(shù) Sham組 CCI組 術(shù)后立即注射0.9%氯化鈉溶液 Cef預防組 第7天開始注射0.9%氯化鈉溶液 Cef 治療組正常 42 ±14 33.6 ±14.1 35.4 ±14.9 38 ±17 35.4 ±14.9 33.7 ±14.1術(shù)后第1 天 39 ±12 38.8 ±11.6 26.8 ±14.9 42 ±14 35.3 ±15.0 33.7 ±14.1術(shù)后第3 天 42 ±14 10.8 ±4.3* 15.6 ±4.5 11 ±4 13.2 ±4.5 14.3 ±4.5術(shù)后第5 天 42 ±14 7.6 ±2.9* 8.6 ±1.6 13 ±4 9.5 ±1.6 8.4 ±1.4術(shù)后第7 天 48 ±11 6.5 ±1.8* 7.0 ±1.3 27 ±12# 7.0 ±1.3 7.2 ±1.1術(shù)后第9天 48±12 7.4±2.72* － － 7.3±3.3 9.0±1.5術(shù)后第11天 42±14 6.2±1.9* － － 5.7±2.0 12.0±3.9術(shù)后第14天 42±14 4.8±2.0* － － 5.1±2.3 24.6±12.9△

圖2 CCI后機械縮足反射閾值的變化和腹腔注射Cef及0.9%氯化鈉溶液后對CCI后機械縮足反射閾值的影響

3 討論

CCI模型是目前神經(jīng)病理性疼痛研究中應用最廣泛的模型，制作簡便、穩(wěn)定，能較好的模擬臨床神經(jīng)損傷后的痛覺過敏現(xiàn)象［4］。本實驗觀察到，CCI大鼠術(shù)后第1天在坐骨神經(jīng)結(jié)扎側(cè)即可見足趾部卷曲、足外翻、跋行，行走時著地時間明顯縮短，足部邊緣著地，有明顯的后肢保護現(xiàn)象出現(xiàn)。在術(shù)后第3天，坐骨神經(jīng)結(jié)扎側(cè)出現(xiàn)痛覺過敏現(xiàn)象，熱縮足反射潛伏期和機械縮足反射閾值開始降低，到術(shù)后第5～7天達最低值，持續(xù)到所測試的第14天。這些變化同文獻報道［5］的一致。表明動物出現(xiàn)了病理性痛和痛覺過敏。

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的興奮性氨基酸，參與脊髓傷害性信息的傳遞。由于沒有谷氨酸代謝酶，所以胞外谷氨酸的攝取主要靠高效的谷氨酸轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)來實現(xiàn)［6，7］。

研究發(fā)現(xiàn)，通過連續(xù)腹腔注射Cef 7 d后，Cef可通過血腦屏障進入腦和脊髓，可以選擇性地誘發(fā)編碼GLT-1谷氨酸轉(zhuǎn)運體的基因轉(zhuǎn)錄，增加GLT-1的腦內(nèi)表達，并增強其功能活性［3］。本實驗觀察到腹腔連續(xù)注射NS對CCI誘導的熱痛敏和機械性痛敏無影響，在CCI大鼠手術(shù)后大鼠出現(xiàn)痛覺過敏前，立即腹腔注射Cef 7 d后，發(fā)現(xiàn)CCI大鼠CCI側(cè)后肢在術(shù)后第5天和第7天熱縮足反射潛伏期同NS對照組相比明顯延長，但機械縮足反射閾值在術(shù)后第7天同對照組相比才明顯升高;在CCI大鼠手術(shù)后第7天出現(xiàn)痛覺過敏后再連續(xù)腹腔注射Cef，注射7天后，發(fā)現(xiàn)CCI大鼠CCI側(cè)后肢在術(shù)后第11天和第14天熱縮足反射潛伏期同NS對照組相比同樣明顯延長，機械縮足反射閾值在術(shù)后第14天同對照組相比才明顯升高。因此推測腹腔注射Cef通過使脊髓GLT-1表達增加減輕了CCI誘導的熱痛敏和機械性痛敏。谷氨酸轉(zhuǎn)運體在病理性疼痛中起到重要的作用，在不同的病理性疼痛情況下，應用谷氨酸轉(zhuǎn)運體的抑制劑或激動劑后對疼痛可能通過不同的機制產(chǎn)生抑制或增強作用，因此，需要更進一步的研究來探索谷氨酸轉(zhuǎn)運體在病理性疼痛中的作用為病理性疼痛的防治提供新的方法和依據(jù)。

1 Faden AI，Demediuk P，Panter SS，et al.The role of excitatory amino acids and NMDA receptors in traumatic brain injury.Science，1989，244:798.

2 Seal RP，Amara SG.Excitatory amino acid transporters:a family in flux.Annu Rev Pharmacol Toxicol，1999，39:431-456.

3 Rothstein JD，Patel S，Regan MR，et al.β-lactam antibiotics offer neuroprotection by increasing glutamate transporter expression.Nature，2005，6:73-77.

4 Bennett GJ，Xie YK.A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorder of pain sensation like those seen in man.Pain，1988，33:87-107.

5 Mao J，Sung B，Ji RR，et al.Neuronal apoptosis associated with morphine tolerance:evidence for an opioid-induced neurotoxic mechanism.J Neurosci，2002，22:7650-7661.

6 Robinson MB，Dowd LA.Heterogeneity and functional properties of subtypes of sodium-dependent glutamate transporters in the mammalian central nervous system.Adv Pharmacol，1997，37:69-115.

7 Danbolt NC.Glutamate uptake.Prog Neurol，2001，65:1-105.