HPLC測定香砂枳術(shù)丸中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的含量

何培根　李志浩　劉菁

[摘 要] 目的：建立同時測定香砂枳術(shù)丸中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ含量方法。方法：采用DIONEX C18色譜柱（250mm×4.6mm，5?m），流動相：乙腈：甲醇：0.1%磷酸溶液（11：46：43），檢測波長為222nm，柱溫：35℃，流速為1.0mL·min-1。結(jié)果：白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ分別在0.1～2.0?g·mL-1（γ=0.9997）和0.2～4.0?g·mL-1（γ=0.9998）濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為98.7%，98.0% ；RSD 分別為0.68%、1.15%。結(jié)論：本方法簡便，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 香砂枳術(shù)丸；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ；HPLC

中圖分類號：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：2055-5200（2014）02-064-03

香砂枳術(shù)丸為衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)收載之品種 [1]。由白術(shù)（Rhizoma Atractylodis Macrocephalae）、木香（Radix Aucklandiae）、枳實(shí)（Fructus Aurantii Immaturus）、砂仁（Fructus Amomi）等四味中藥所組成的復(fù)方中成藥制劑。出自《景岳全書》，具有健脾開胃，行氣消痞之功效。用于脾虛氣滯，脘腹痞悶，食欲不振，大便溏軟等癥。有實(shí)驗表明本制劑對不同 的胃腸機(jī)能狀態(tài)呈不同的作用，對胃腸運(yùn)動具有調(diào)節(jié)作用：既能抑制新斯的明引起的胃腸運(yùn)動亢進(jìn)，又能改善阿托品所致的胃腸抑制。能顯著增加膽汁、胰液分泌，但對胃液分泌有顯著抑制作用，與甲氰咪呱有協(xié)同作用。能顯著增加胰脂肪酶活性，顯著抑制胃蛋白酶活性[2]。白術(shù)在本方中用量較大，具有健脾益氣、燥濕利水之功效，主要用于脾虛食少、痰飲等癥。其所含的內(nèi)酯類化合物具有調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動、提高免疫力和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收的功能[3-4]。筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)，采用高效液相色譜法測定白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量，可提高本制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保臨床療效。

1 儀器與試藥

DIONEX液相色譜儀（Chemeleon色譜工作站，UV檢測器），島津AEU-210型電子天平（d=0.1mg，日本島津）；KQ-100型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器廠）；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品（西安交通大學(xué)藥物分析工程中心提供，純度99.6%），甲醇，乙腈（色譜純，F(xiàn)ish公司），水為去離子水，其他試劑均為分析純。香砂枳術(shù)丸（北京同仁堂股份有限公司，規(guī)格：10.0g/袋）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

分別取經(jīng)減壓干燥器干燥至恒重的白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含0.002mg白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和每1mL含0.004mg白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的溶液，分別吸取上述兩種對照品溶液各5mL至10mL量瓶中，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液及陰性對照溶液的制備

取本品5袋，除去包衣，研細(xì)，取約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，浸漬1h，超聲處理（功率300W，頻率50kHz）30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過（0.45?m微孔濾膜），作為供試品溶液。按上述方法制得不含白術(shù)的陰性對照溶液。

2.3 色譜條件

采用DIONEX C18（250mm×4.6mm ，5?m）色譜柱；流動相：乙腈：甲醇：0.2%磷酸溶液（46：11：43）[5-10]；檢測波長222nm，流速：1.0mL·min-1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10?L；在此色譜條件下，兩峰理論塔板數(shù)不小于3000。色譜圖見圖1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

分別精密吸取混合對照品儲備溶液0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0mL置10mL量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，分別取10?L注入液相色譜儀，測定，以濃度對峰面積積分值進(jìn)行線性回歸，線性方程分別為：白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ：Y=62.473X+0.1467，r=0.9997；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ：Y=59.46X-0.2213，r=0.9998，結(jié)果表明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ在0.1～2.0?g·mL-1；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在0.2～4.0?g·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

取混合對照品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積的RSD為1.31%、1.47%。

2.6 穩(wěn)定性試驗

吸取“2.2”項下的供試品溶液，室溫下分別在0，2，4， 8，12h測定峰面積積分值，結(jié)果RSD分別為1.62%、1.83%，處理后的樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批樣品（批號20111206）5份，按“2.2”項下的方法制成供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，計算其平均含量分別為0.024、0.047mg/g，RSD為1.87%和1.18%。結(jié)果見表1。

2.8 加樣回收率試驗

取6份已知含量（批號20111206，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ分別為0.024、0.047mg/g）的香砂枳術(shù)丸約0.5g，精密加入混合對照品溶液12mL，依法制備供試品溶液，在選定的色譜條件下進(jìn)樣并計算回收率，結(jié)果見表2。

2.9 樣品測定

將制備好的樣品在高效液相色譜儀上測定含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果（n=3）

批號 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（mg/g） 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（mg/g）

20111206 0.047 0.024

20111218 0.045 0.023

20120104 0.046 0.023

20120115 0.052 0.028

20120124 0.046 0.024

3 討論

3.1 流動相的選擇

曾采用不同流動相系統(tǒng)，但該兩種白術(shù)活性成分均有較寬色譜峰形，塔板數(shù)也很低，拖尾明顯，定量分析誤差較大。為了能準(zhǔn)確分析測定，對不同流動相比例和溶液pH值進(jìn)行調(diào)整，流動相用甲醇-乙腈混合作為有機(jī)相，兩者的色譜得到明顯改善，再用0.1%磷酸改變流動相pH值范圍，調(diào)整比例為乙腈：甲醇：0.2%磷酸溶液（11：46：43）兩者色譜峰與雜質(zhì)峰能較好分開。而當(dāng)流動相中不添加磷酸溶液時白術(shù)內(nèi)酯I色譜峰為一平頭峰，且峰寬超過2min。因此確定本系統(tǒng)作為流動相系統(tǒng)。

3.2 提取方法的選擇

分別考察了乙醇、甲醇、乙酸乙酯等提取溶劑，提取方式考察了超聲、回流等，提取時間分別考察了20min、30 min、1 h，提取次數(shù)分別為1次、2次，均進(jìn)行單因素實(shí)驗。結(jié)果，甲醇超聲30 min 1次即可提取完全（說明：在“2.2 供試品溶液及陰性對照溶液的制備”中提到供試品溶液的制備方法為“超聲處理（功率300W，頻率50kHz）30min”，即規(guī)定了超聲處理的時間和次數(shù)），與回流提取相比結(jié)果相差很小，為節(jié)約提取時間，提高實(shí)驗效率，確定用甲醇超聲提取作為提取方法。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第一冊[S].WS3-B-0114-89，1998：116.

[2] 譚毓治，胡因銘，趙詩云，等.香砂枳術(shù)丸對消化系統(tǒng)的藥理作用[J].中藥藥理與臨床，1992，8（3）：9-11.

[3] 李偉， 文紅梅， 崔小兵， 等. 白術(shù)的化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥， 2007， 38（10）： 1460-1462.

[4] 宿廷敏，王敏娟，阮時寶.白術(shù)的化學(xué)成分及藥理作用研究概述[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版）：2008，3（2）：32-35.

[5] 李偉，文紅梅，張愛華，等.白術(shù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究I—HPLC法測定2種白術(shù)內(nèi)酯的含量[J]. 藥物分析雜志，2001，21（3）：170-172.

[6] 李志浩，瞿京紅，劉菁，等.高效液相色譜法測定固本咳喘片中白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 的含量[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，13（4）：33-35.

[7] 李志浩，李鵬，朱雪松，等.反相高效液相色譜法測定白術(shù)茯苓顆粒中白術(shù)內(nèi)酯I與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，29（5）：662-663.

[8] 李鵬，陳琴華，李志浩，等.超聲法提取白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的正交實(shí)驗研究[J].中藥材，2009，32（10）：1615-1618.

[9] 傅春升， 楊培民. 麩炒白術(shù)的質(zhì)量研究[J]. 中成藥，2007，29（1）：92-95.

[10] 陳琴華，李鵬，何婧，等. 白術(shù)飲片HPLC指紋圖譜研究[J]. 中藥材，2009，32（1）：35-38.

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3 討論

3.1 流動相的選擇

曾采用不同流動相系統(tǒng)，但該兩種白術(shù)活性成分均有較寬色譜峰形，塔板數(shù)也很低，拖尾明顯，定量分析誤差較大。為了能準(zhǔn)確分析測定，對不同流動相比例和溶液pH值進(jìn)行調(diào)整，流動相用甲醇-乙腈混合作為有機(jī)相，兩者的色譜得到明顯改善，再用0.1%磷酸改變流動相pH值范圍，調(diào)整比例為乙腈：甲醇：0.2%磷酸溶液（11：46：43）兩者色譜峰與雜質(zhì)峰能較好分開。而當(dāng)流動相中不添加磷酸溶液時白術(shù)內(nèi)酯I色譜峰為一平頭峰，且峰寬超過2min。因此確定本系統(tǒng)作為流動相系統(tǒng)。

3.2 提取方法的選擇

分別考察了乙醇、甲醇、乙酸乙酯等提取溶劑，提取方式考察了超聲、回流等，提取時間分別考察了20min、30 min、1 h，提取次數(shù)分別為1次、2次，均進(jìn)行單因素實(shí)驗。結(jié)果，甲醇超聲30 min 1次即可提取完全（說明：在“2.2 供試品溶液及陰性對照溶液的制備”中提到供試品溶液的制備方法為“超聲處理（功率300W，頻率50kHz）30min”，即規(guī)定了超聲處理的時間和次數(shù)），與回流提取相比結(jié)果相差很小，為節(jié)約提取時間，提高實(shí)驗效率，確定用甲醇超聲提取作為提取方法。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第一冊[S].WS3-B-0114-89，1998：116.

[2] 譚毓治，胡因銘，趙詩云，等.香砂枳術(shù)丸對消化系統(tǒng)的藥理作用[J].中藥藥理與臨床，1992，8（3）：9-11.

[3] 李偉， 文紅梅， 崔小兵， 等. 白術(shù)的化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥， 2007， 38（10）： 1460-1462.

[4] 宿廷敏，王敏娟，阮時寶.白術(shù)的化學(xué)成分及藥理作用研究概述[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版）：2008，3（2）：32-35.

[5] 李偉，文紅梅，張愛華，等.白術(shù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究I—HPLC法測定2種白術(shù)內(nèi)酯的含量[J]. 藥物分析雜志，2001，21（3）：170-172.

[6] 李志浩，瞿京紅，劉菁，等.高效液相色譜法測定固本咳喘片中白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 的含量[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，13（4）：33-35.

[7] 李志浩，李鵬，朱雪松，等.反相高效液相色譜法測定白術(shù)茯苓顆粒中白術(shù)內(nèi)酯I與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，29（5）：662-663.

[8] 李鵬，陳琴華，李志浩，等.超聲法提取白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的正交實(shí)驗研究[J].中藥材，2009，32（10）：1615-1618.

[9] 傅春升， 楊培民. 麩炒白術(shù)的質(zhì)量研究[J]. 中成藥，2007，29（1）：92-95.

[10] 陳琴華，李鵬，何婧，等. 白術(shù)飲片HPLC指紋圖譜研究[J]. 中藥材，2009，32（1）：35-38.

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3 討論

3.1 流動相的選擇

曾采用不同流動相系統(tǒng)，但該兩種白術(shù)活性成分均有較寬色譜峰形，塔板數(shù)也很低，拖尾明顯，定量分析誤差較大。為了能準(zhǔn)確分析測定，對不同流動相比例和溶液pH值進(jìn)行調(diào)整，流動相用甲醇-乙腈混合作為有機(jī)相，兩者的色譜得到明顯改善，再用0.1%磷酸改變流動相pH值范圍，調(diào)整比例為乙腈：甲醇：0.2%磷酸溶液（11：46：43）兩者色譜峰與雜質(zhì)峰能較好分開。而當(dāng)流動相中不添加磷酸溶液時白術(shù)內(nèi)酯I色譜峰為一平頭峰，且峰寬超過2min。因此確定本系統(tǒng)作為流動相系統(tǒng)。

3.2 提取方法的選擇

分別考察了乙醇、甲醇、乙酸乙酯等提取溶劑，提取方式考察了超聲、回流等，提取時間分別考察了20min、30 min、1 h，提取次數(shù)分別為1次、2次，均進(jìn)行單因素實(shí)驗。結(jié)果，甲醇超聲30 min 1次即可提取完全（說明：在“2.2 供試品溶液及陰性對照溶液的制備”中提到供試品溶液的制備方法為“超聲處理（功率300W，頻率50kHz）30min”，即規(guī)定了超聲處理的時間和次數(shù)），與回流提取相比結(jié)果相差很小，為節(jié)約提取時間，提高實(shí)驗效率，確定用甲醇超聲提取作為提取方法。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第一冊[S].WS3-B-0114-89，1998：116.

[2] 譚毓治，胡因銘，趙詩云，等.香砂枳術(shù)丸對消化系統(tǒng)的藥理作用[J].中藥藥理與臨床，1992，8（3）：9-11.

[3] 李偉， 文紅梅， 崔小兵， 等. 白術(shù)的化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥， 2007， 38（10）： 1460-1462.

[4] 宿廷敏，王敏娟，阮時寶.白術(shù)的化學(xué)成分及藥理作用研究概述[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版）：2008，3（2）：32-35.

[5] 李偉，文紅梅，張愛華，等.白術(shù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究I—HPLC法測定2種白術(shù)內(nèi)酯的含量[J]. 藥物分析雜志，2001，21（3）：170-172.

[6] 李志浩，瞿京紅，劉菁，等.高效液相色譜法測定固本咳喘片中白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 的含量[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，13（4）：33-35.

[7] 李志浩，李鵬，朱雪松，等.反相高效液相色譜法測定白術(shù)茯苓顆粒中白術(shù)內(nèi)酯I與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，29（5）：662-663.

[8] 李鵬，陳琴華，李志浩，等.超聲法提取白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的正交實(shí)驗研究[J].中藥材，2009，32（10）：1615-1618.

[9] 傅春升， 楊培民. 麩炒白術(shù)的質(zhì)量研究[J]. 中成藥，2007，29（1）：92-95.

[10] 陳琴華，李鵬，何婧，等. 白術(shù)飲片HPLC指紋圖譜研究[J]. 中藥材，2009，32（1）：35-38.