利用微生物技術(shù)生產(chǎn)肌苷酸和鳥(niǎo)苷酸的進(jìn)展

王美玲

(青島科技大學(xué)，山東青島 266042)

1 IMP和GMP的作用

1.1 生理機(jī)能

核苷酸是細(xì)胞生理機(jī)能中必不可少的生物元素，因?yàn)樗鼈兪荄NA和RNA的結(jié)構(gòu)組成部分，是能量載體(即ATP和GTP)、輔酶因子(即NAD+和NADP+)和一些維生素(維生素B1、B2和B9)的結(jié)構(gòu)成分。嘌呤營(yíng)養(yǎng)不足和核苷酸代謝的紊亂會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的疾?。?］。

IMP是生物合成嘌呤的核心分子，它的生物合成是受到嚴(yán)格調(diào)控的。GMP既可以經(jīng)IMP從頭合成，又可以經(jīng)補(bǔ)救途徑合成，而且它是二磷酸鳥(niǎo)苷酸(GDP)、三磷酸鳥(niǎo)苷酸(GTP)、鳥(niǎo)苷四磷酸(ppGpp)和環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)的前體分子，他們?cè)谏矬w中的重要性是眾所周知的［2］。此外，這些嘌呤核苷酸可用作食品添加劑，在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中具有重大經(jīng)濟(jì)利益。

1.2 營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用

IMP和GMP是天然鮮味的來(lái)源，可以用作食品中的風(fēng)味添加劑，通常和谷氨酸鹽一起用于增強(qiáng)食品鮮味［3］。除了內(nèi)在調(diào)味功能，IMP和GMP作為食品添加劑的營(yíng)養(yǎng)功能也已經(jīng)得到了相關(guān)報(bào)道。IMP和GMP既可以改善一些無(wú)味食物的適口性，也可以改善低鹽食物的可接受性，有利于緩解老年人由于味覺(jué)喪失而導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)缺乏狀況，有利于蛋白質(zhì)、必要的維生素和礦物質(zhì)的攝入［4］。因此，它們?cè)趹?yīng)用生物技術(shù)領(lǐng)域引起了廣泛的興趣。

有報(bào)道稱IMP能夠刺激成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突的生長(zhǎng)，具有保護(hù)神經(jīng)、強(qiáng)心劑和免疫調(diào)節(jié)的作用［5］;而GMP能發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和促神經(jīng)生長(zhǎng)的效果，這對(duì)于神經(jīng)的生長(zhǎng)非常重要［6］;此外，一些核苷衍生物是強(qiáng)有力的抗病毒藥物，已經(jīng)被提議作為化療藥物［7］。最后，有報(bào)告稱IMP和GMP都具有抗氧化活性，因此，可以保護(hù)細(xì)胞免受活性氧自由基的侵害［8］。

2 IMP和GMP的生物合成及調(diào)節(jié)

IMP和GMP都是嘌呤合成途徑的代謝產(chǎn)物。它們的生物合成方式有兩種:既可以通過(guò)從頭合成途徑由5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)和谷氨酰胺獲得，另外，嘌呤堿基也可以通過(guò)補(bǔ)救途徑直接轉(zhuǎn)化為核苷—磷酸衍生物［9］。同時(shí)，由于IMP和GMP可以保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和進(jìn)行能源供應(yīng)，在細(xì)胞生理中占據(jù)關(guān)鍵角色，其合成途徑是一個(gè)受到嚴(yán)格調(diào)控的過(guò)程。

2.1 從頭合成途徑

從頭合成途徑把谷氨酰胺和PRPP經(jīng)由10個(gè)不同的酶催化過(guò)程轉(zhuǎn)化為IMP。IMP是嘌呤代謝途徑的中心物質(zhì)，在隨后的兩個(gè)酶催化過(guò)程中它可以被相應(yīng)的酶催化為 AMP或 GMP［10］。IMP先后被AMP合成酶和AMP裂解酶催化生成AMP。在嘌呤代謝的另一途徑中，IMP脫氫酶將IMP轉(zhuǎn)化為黃嘌呤核苷酸(XMP)，然后GMP合成酶將XMP催化為GMP［11］。

2.2 補(bǔ)救合成途徑

在補(bǔ)救途徑中，PRPP可以被某些特定的磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶催化為自由堿基，進(jìn)行堿基的循環(huán)利用。補(bǔ)救途徑中的酶催化途徑如下:腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶分別催化腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤生成 AMP、IMP、XMP和GMP［12］。此外，一些堿基和核苷酸可以被特定的氧化酶類和脫氨酶所催化。例如腺苷酸脫氨酶把AMP催化為 IMP，GMP還原酶把 GMP催化為IMP［13］等。

2.3 合成過(guò)程的調(diào)節(jié)

在真核生物中，大多數(shù)與IMP和GMP合成相關(guān)的基因都受到細(xì)胞外嘌呤的負(fù)調(diào)控，同時(shí)代謝水平的調(diào)控也通過(guò)終產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)方式存在于嘌呤代謝途徑中［14］。例如PRPP酰胺轉(zhuǎn)移酶被IMP所抑制，并且受到轉(zhuǎn)錄水平和代謝水平的雙重調(diào)節(jié)［15］;IMP脫氫酶則被GMP抑制，而與GMP合成有關(guān)的基因是受到鳥(niǎo)嘌呤反應(yīng)元素(GRE)的特別調(diào)控，其可以被GDP或GDP衍生物所抑制［16］。

在一些微生物如大腸桿菌(E.Coli)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)中，與IMP和GMP生物合成相關(guān)基因大部分是以Pur操縱子的形式存在的，PurR基因是Pur操縱子的主要調(diào)節(jié)基因［17］。當(dāng)IMP或GMP從環(huán)境中可以獲得時(shí)，可以增強(qiáng)PurR基因抑制目標(biāo)基因表達(dá)的作用效果［18］。作用于PurR基因表達(dá)的效應(yīng)物在不同物種間是不同的，而且在E.coli和B.subtilis中PurR阻遏物的功能也有一些差異［19］。另外，據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，B.subtilis中 Pur操縱子的表達(dá)也受到一種鳥(niǎo)苷敏感型的核糖開(kāi)關(guān)的調(diào)控，它可以負(fù)調(diào)控操縱子中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)［20］。

3 微生物菌種

所有微生物都能夠合成嘌呤(IMP和GMP)，而且其產(chǎn)率隨著菌種的不同變化很大［21］。因此，要定義一個(gè)“嘌呤核苷酸生產(chǎn)微生物”不僅要看微生物合成IMP或GMP的能力，更重要的是評(píng)估其把產(chǎn)物分泌到外界培養(yǎng)基中的能力。對(duì)于所謂的“嘌呤核苷酸生產(chǎn)微生物”，可以根據(jù)有關(guān)于嘌呤代謝通路的遺傳學(xué)和代謝知識(shí)，通過(guò)隨機(jī)誘變或代謝工程等方法大幅度的提高其產(chǎn)物產(chǎn)率。

枯草芽孢桿菌(B.Subtilis)、谷氨酸棒狀桿菌(C.Glutamicum)和產(chǎn)氨棒桿菌(C.Ammoniagens)是傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)上具有最高產(chǎn)量的潛力菌種［22］。這些微生物能夠在培養(yǎng)基中積累大量的肌苷酸和鳥(niǎo)苷酸，從而避免復(fù)雜的和昂貴的回收提取。其他微生物也被用于生產(chǎn)GMP和IMP:例如可以利用鏈霉菌(Streptomycetes)菌種生產(chǎn)GMP，利用索多斯微球菌(Micrococcus sodonensis)和檸檬節(jié)桿菌(Arthrobacter citreus)生產(chǎn)IMP［24］;最近也開(kāi)始利用解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)生產(chǎn)核苷酸，并且其產(chǎn)量可能與B.subtilis相當(dāng);E.coli作為一種模式生物，由于其基因組信息和基因組工具較多，也被認(rèn)為是潛在的嘌呤核苷酸生產(chǎn)微生物，因此可以通過(guò)基因工程的手段過(guò)量表達(dá)嘌呤核苷酸［25］。

4 IMP和GMP的工業(yè)化生產(chǎn)

IMP和GMP作為風(fēng)味增強(qiáng)劑已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，迄今為止已經(jīng)發(fā)展了幾種方法來(lái)改善生產(chǎn)流程。主要有以下兩種策略:①RNA破碎和核苷酸提取;②通過(guò)發(fā)酵的方式生產(chǎn)嘌呤核苷酸。

4.1 以RNA破碎的方式提取IMP和GMP

第一種方法是基于細(xì)胞培養(yǎng)液的RNA提取，通過(guò)后續(xù)水解過(guò)程獲得自由核苷酸［26］。大多數(shù)用于生產(chǎn)RNA的酵母菌都是具有高RNA含量的菌種，例如 Candida、Pichia、Saccharomyces或 Hansenula，而且已經(jīng)進(jìn)行了深入研究和基因修飾可以實(shí)現(xiàn)核苷酸的過(guò)表達(dá)［27］。

酵母菌的自溶是由熱處理誘導(dǎo)的，然后通過(guò)乙醇沉淀RNA，因此可以通過(guò)化學(xué)或酶法獲得獲取自由核苷酸。在化學(xué)水解RNA過(guò)程中利用Ca(OH)2誘導(dǎo)進(jìn)行核酸合成的干擾;相比之下，酶法需要溶解5'-磷酸二酯酶來(lái)獲得自由核苷酸，使用最廣泛的酶是來(lái)自青霉菌(Penicillium)的核酸酶P1［28］。

利用RNA生產(chǎn)IMP和GMP的主要缺點(diǎn)是副產(chǎn)品濃度相對(duì)較高，例如AMP、CMP和UMP等，它們不具有任何風(fēng)味活性。因此，需要利用腺嘌呤脫氨酶的活性把AMP轉(zhuǎn)化為IMP以及通過(guò)活性炭吸附去除 CMP 和 UMP［29］。

4.2 通過(guò)發(fā)酵方式從培養(yǎng)液中提取嘌呤核苷酸

第二種方法是直接通過(guò)發(fā)酵工程從菌體培養(yǎng)液中提取嘌呤核苷酸，所用的菌種常為通過(guò)隨機(jī)誘變方法獲得產(chǎn)量增高的突變菌株。

肌苷酸和鳥(niǎo)苷酸通常由發(fā)酵生產(chǎn)其前體肌苷和鳥(niǎo)苷，然后再經(jīng)過(guò)化學(xué)處理或酶催化形成相應(yīng)的磷酸衍生物［30］。最近科學(xué)家們通過(guò)基因突變的策略找到了直接生產(chǎn)IMP和GMP的方法［31］:通過(guò)對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷性菌株B.subtilis和C.ammoniagens的突變實(shí)現(xiàn)了IMP的過(guò)表達(dá)，該菌株具有較低的5-核苷酸酶活性和較高的細(xì)胞膜通透性，IMP的產(chǎn)率達(dá)到了20～27 g/L;同樣的，在不同的鳥(niǎo)嘌呤缺陷型菌種如 C.glutamicum、C.ammoniagenes和 B.subtilis中，由于5-核苷酸酶活性較低也已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了IMP的過(guò)表達(dá)，最大產(chǎn)率為19 g/L。相比之下，尚未有直接生產(chǎn)GMP的報(bào)道，因此GMP是從IMP過(guò)表達(dá)菌株中經(jīng)過(guò)兩步反應(yīng)過(guò)程生產(chǎn)的，即通過(guò)IMP氨基酶把IMP轉(zhuǎn)化為GMP。最有效的生產(chǎn)菌株可從40 g/L IMP 中生產(chǎn)出 34.8 g/LGMP［32］。

5 菌株改造:代謝過(guò)程調(diào)控

在嘌呤合成途徑中通過(guò)基因工程的手段(主要是基因敲除和代謝調(diào)整等)重新改變代謝的物質(zhì)流向，使代謝朝著合成肌苷和鳥(niǎo)苷的方向進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)IMP和GMP的過(guò)表達(dá)。

在B.subtilis中，為了生產(chǎn)肌苷酸，進(jìn)行了理性代謝工程探索。首先選擇性失活腺苷酸琥珀酸合酶和肌苷5-磷酸脫氫酶，阻止IMP向AMP或GMP的轉(zhuǎn)化;然后，使鳥(niǎo)苷/肌苷磷酸化酶失活，減少肌苷降解;最終，對(duì)嘌呤操縱子進(jìn)行修飾，破壞嘌呤操縱子阻遏基因和5-UTR中鳥(niǎo)苷核糖開(kāi)關(guān)的基因，優(yōu)化Pur啟動(dòng)子中-10序列的堿基以增強(qiáng)嘌呤操縱子的轉(zhuǎn)錄活性。最終獲得的突變菌株在30 g/L的葡萄糖培養(yǎng)基中可以獲得6 g/L的IMP［33］。

近期通過(guò)多種策略試圖構(gòu)建生產(chǎn)GMP的C.glutamicum菌株［34］，這些策略主要包括:①通過(guò)刪除編碼6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的Pgi基因，增加核糖5-磷酸前體的可用性;②通過(guò)下調(diào)編碼PRPP酰胺轉(zhuǎn)移酶的PurF基因的表達(dá)，克服調(diào)節(jié)—抑制節(jié)點(diǎn)的瓶頸;③催化生產(chǎn)GMP的反應(yīng)，如激活I(lǐng)MP—脫氫酶(催化把IMP轉(zhuǎn)化為GMP)。通過(guò)13C代謝通量分析和代謝組分析確定了碳通量在工程菌細(xì)胞內(nèi)的分布，由此確認(rèn)PurA菌株是生產(chǎn)GMP的最優(yōu)菌株［35］。

總之，在提高肌苷酸和鳥(niǎo)苷酸積累量的代謝過(guò)程中具有相同的部分特征，主要修飾范圍可以分成五個(gè)部分:①中心代謝通量的重定向-增加核糖-5-磷酸的供應(yīng)量;②從頭合成途徑的調(diào)節(jié);③救助途徑的修飾;④調(diào)控因子的改變;⑤增加分泌量。

6 結(jié)論

嘌呤類核苷酸的產(chǎn)率隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步而不斷增加。合理的代謝設(shè)計(jì)和基因工程等現(xiàn)代技術(shù)相繼出現(xiàn)在核苷酸生產(chǎn)領(lǐng)域，與前期的隨機(jī)誘變方法相比有了突破性的提高。隨著系統(tǒng)生物學(xué)的進(jìn)步和合成生物學(xué)的快速發(fā)展，可為將來(lái)進(jìn)一步提高發(fā)酵過(guò)程的生產(chǎn)效率提供操作基礎(chǔ)。

［1］Harambat J，Bollée G，Daudon M，et al.Adenine phosphoribosyl transferase deficiency in children［J］.Pediatr Nephrol，2012，27(4):571-579.

［2］Kappock T J，Ealick S E，Stubbe J.Modular evolution of the purine biosyntheticpathway［J］.Curr Opin Chem Biol，2000，4(5):567-572.

［3］Kurihara K，Kashiwayanagi M.Physiological studies on umami taste［J］.Nutr，2000，130(4S Suppl):931S-4S.

［4］Jinap S，Glutamate H P.Its applications in food and contribution to health［J］.Appetite，2010，55(1):1-10.

［5］Tsuda K.Inosine calcium channels and neuro-protection against ischemic brain injury［J］.Stroke，2005，36(9):1823.

［6］Rathbone M，Pilutti L，Caciagli F，et al.Neurotrophic effects of extracellular guanosine［J］.Nucleos Nucleot Nucl，2008，27(6):666-672.

［7］Gumina G，Song G，Chu C.L-Nucleosides as chemother apeuticagents［J］.FEMSMicrobiolLett，2001，202(1):9-15.

［8］Gudkov S V，Shtarkman I N，Smirnova V S，et al.Guanosine and inosine display antioxidant activity，protect DNA in vitro from oxidative damage induced by reactive oxygen species，and serve as radio protectors in mice［J］.Radiat Res，2006，165(5):538-545.

［9］Rebora K，Desmoucelles C，Borne F，et al.Yeast AMP pathway genes respond to adenine through regulated synthesis of a metabolic intermediate［J］.Mol Cell Biol，2001，21(23):7901-7912.

［10］Camici M，Micheli V，Ipata P，et al.Pediatric neurological syndromes and inborn errors of purine metabolism［J］.Neurochem Int，2010，56(3):367-378.

［11］Benowitz L I，Goldberg D E，Irwin N.Inosine stimulates axon growth in vitro and in the adult CNS［J］.Prog Brain Res，2002，137(2):389-399.

［12］Ljungdahl P，Daignan-Fornier B.Regulation of amino acid，nucleotide，and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae［J］.Genetics，2012，190(3):885-929.

［13］Martinelli L，Ducati R，Rosado L，et al.Recombinant Escherichia coli GMP reductase:kinetic，catalytic and chemical mechanisms，and thermodynamics of enzymeligand binary complex formation［J］.Mol Biosyst，2011，7(4):1289-1305.

［14］Escobar-Henriques M，Daignan-Fornier B.Transcriptional regulation of the yeast GMP synthesis pathway by its end products［J］.Biol Chem，2001，276(2):1523-1530.

［15］Jiménez A，Santos M A，Pompejus M，et al.Metabolic engineering of the purine pathway for riboflavin production in Ashbya gossypii［J］.Appl Environ Microbiol，2005，71(10):5743-5751.

［16］Sun H，Li N，Wang X，Chen T，et al.Molecular cloning and characterization of an ovel muscle adenylo succinate synthetase，AdSSL1，from human bone marrow stromal cells［J］.Mol Cell Biochem，2005，269(1-2):85-94.

［17］Johansen L，Nygaard P，Lassen C，et al.Definition of a second Bacillus subtilis pur regulon comprising the pur and xpt-pbuX operons plus pbuG，nupG，and pbuE［J］.Bacteriol，2003，185(17):5200-5209.

［18］Cho B K，F(xiàn)ederowicz S A，Embree M，et al.The PurR regulon in escherichia coli K-12 MG1655［J］.Nucleic Acids Res，2011，39(15):6456-6464.

［19］Asahara T，Mori Y，Zakataeva N P，et al.Accumulation of gene-targeted Bacillus subtilis mutations that enhance fermentative inosine production［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，87(6):2195-207.

［20］Mandal M，Boese B，Barrick J E，et al.Riboswitches control fundamental biochemical pathways in Bacillus subtilis and other bacteria［J］.Cell，2003，30(113):577-86.

［21］Chaudhary K，Darling J A，F(xiàn)ohl L M，et al.Purine salvage pathways in the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii［J］.Biol Chem，2004，279(30):31221-31227.

［22］Kuninaka A.Nucleotides and related compounds［J］.Biotech:Products of Primary Metabolism，2008，6(2):15-18.

［23］Schwartz J，Margalith P.Production of flavour-enhancing materials by streptomycetes:strain improvement andfermentation［J］.ApplBacteriol，1972，35(2):271-278.

［24］Zakataeva N P，Romanenkov D V，Skripnikova V S，et al.Wild-type and feed back resistant phosphoribosyl pyrophosphate synthetases from Bacillus amyloliquefaciens:purification，characterization，and application to increase purine nucleoside production［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2012，93(5):2023-2033.

［25］Matsui H，Kawasaki H，Shimaoka M，et al.Investigatin of various genotype characteristics for inosine accumulation in Escherichia coli W3110［J］.Biotecnhnol Biochem，2001，65(3):570-578.

［26］Chae H，Joo H，In M J.Utilization of brewers yeast cells for the production of food-grade yeast extract Part 1:effects of different enzymatic treatments on solid and protein recovery and flavor characteristics［J］.Bioresour Technol，2001，76(3):253-258.

［27］Lee J S，Hyun K W，Jeong S C，et al.Production of ribonucleotides by autolysis of Pichia anomala mutant and some physiological activities［J］.Microbiol，2004，50(7):489-492.

［28］Shi L E，Ying G Q，Tang Z X，et al.Continuous enzymatic production of 5-nucleotides using free nuclease P1 in ultrafiltration membrane reactor［J］.Membr Sci，2009，345(1-2):217-222.

［29］Yoshimune K，Kugimiya K，Moriguchi M.Purification and characterization of a flavour-enhancing enzyme thermostable adenosine-phosphate deaminase，from thermophilic Aspergillus fumigatus No.4［J］.Ann Microbiol，2005，55(3):267-272.

［30］Mihara Y，Utagawa T，Yamada H，et al.Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii［J］. Appl Environ Microbiol，2000，66(7):2811-2816.

［31］Ramazzina I，Costa R，Cendron L，et al.An aminotransferase branch point connects purine catabolism to amino acid recycling［J］.Nat Chem Biol，2010，6(11):801-806.

［32］Kawai M，Okiyama A，Ueda Y.Taste enhancements between various amino acids and IMP［J］.Chem Senses，2002，27(8):739-745.

［33］Bera A，Zhu J，Zalkin H，et al.Functional dissection of the Bacillus subtilis pur operator site［J］.Bacteriol，2003，185(14):4099-4109.

［34］Peifer S，Barduhn T，Zimmet S，et al.Metabolic engineering of the purine biosynthetic pathway in Corynebacterium glutamicum results in increased intracellular pool sizes of IMP and hypoxanthine［J］.Microb Cell Fact，2012，11(1):138.

［35］Korneli C，David F，Biedendieck R，et al.Getting the big beast to work-systems biotechnology of Bacillus megaterium for novel high-value proteins［J］.Biotechnol，2013，163(2):87-96.