產(chǎn)腸毒素大腸桿菌疫苗在斷奶仔豬中的應(yīng)用

楊佳亮 ，傅勝才 ，楊 青

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長(zhǎng)沙410131）

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌疫苗在斷奶仔豬中的應(yīng)用

楊佳亮1，2，傅勝才2，楊 青1，※

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長(zhǎng)沙410131）

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)是引起新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的主要病原之一。通過(guò)免疫母豬，新生仔豬通?？梢詮某跞楹腿橹玫接行ПＷo(hù)，但在斷奶階段，母乳的保護(hù)消失。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，引起斷奶仔豬腹瀉常見(jiàn)的ETEC菌株均有菌毛F4或F18。這些菌毛是重要的毒力因子，它們使細(xì)菌結(jié)合到宿主易感腸上皮細(xì)胞，在腸內(nèi)定植繁殖，隨后分泌腸毒素引起腹瀉。文章針對(duì)由菌毛F4和/或F18產(chǎn)毒素大腸桿菌引起的腹瀉，概括了在養(yǎng)豬生產(chǎn)中其相關(guān)免疫接種途徑，包括口服弱毒苗和亞單位疫苗、膠囊疫苗和注射免疫接種等。

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌；菌毛；免疫；斷奶仔豬

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起人、豬和牛腸道感染的的一個(gè)主要病原之一。在新生仔豬和斷奶仔豬中，ETEC引起的腹瀉可導(dǎo)致高的發(fā)病率和死亡率，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。菌毛，又稱為粘附素，是ETEC表面的一種纖毛樣物,通過(guò)與宿主小腸上皮細(xì)胞特異受體結(jié)合,使得細(xì)菌在腸黏膜上定植并繁殖產(chǎn)生腸毒素從而導(dǎo)致腹瀉[1]。在豬中，五種ETEC菌毛與腹瀉有關(guān)，分別是：F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F7(F41)和F18。在發(fā)生腹瀉和死亡的新生仔豬、哺乳期仔豬以及剛斷奶的仔豬中，F(xiàn)4菌毛最常見(jiàn)。而F5、F6和F41主要與新生兒腹瀉有關(guān)，F(xiàn)18菌毛則與斷奶仔豬腹瀉密切相關(guān)。F4菌毛的抗原突變體有F4ab、F4ac和F4ad，其中F4ac是目前最常見(jiàn)的。F18有F18ab和F18ac突變體，其中F18ac與斷奶仔豬腹瀉密切相關(guān)，而F18ab主要與水腫性疾病相關(guān)[2]。

ETEC在腸道內(nèi)定植后生長(zhǎng)增殖，隨后釋放腸毒素引發(fā)細(xì)胞內(nèi)水、電解質(zhì)失衡導(dǎo)致水樣腹瀉。ETEC分泌的腸毒素包括不耐熱腸毒素（LT）、耐熱腸毒素 a（STa）、耐熱腸毒素 b（STb）和腸聚集熱穩(wěn)定腸毒素1（EAST1）[3]。雖然大多數(shù)新生仔豬可以通過(guò)免疫后母豬的初乳和乳汁獲得保護(hù)，但是ETEC感染非侵入性胃腸道感染，因此粘膜免疫比系統(tǒng)免疫更為重要。目前市場(chǎng)上有幾種疫苗，包括：帶菌毛的滅活菌、帶LT的純化菌毛或不帶LT的純化菌毛菌應(yīng)用懷孕母豬。但隨著母豬年齡的增大，通過(guò)這些疫苗所獲得免疫逐漸降低；而且在斷奶時(shí)催乳免疫突然消失，導(dǎo)致剛斷奶的仔豬很容易感染腸桿菌。為了保護(hù)剛斷奶的仔豬，積極的腸道粘膜免疫應(yīng)答尤為重要。

1 口服亞單位疫苗的應(yīng)用

在感染時(shí)，由于菌毛在細(xì)菌定植的過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色，使得口服菌毛疫苗的研發(fā)發(fā)展迅速。純化的F4ac菌毛是一種很強(qiáng)的口服免疫原，在斷奶仔豬中，連續(xù)兩天口服1mg后，在第4、7、8和11天可分別導(dǎo)致派伊爾淋巴集結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、血液和固有膜中分泌F4特異性抗體的細(xì)胞出現(xiàn)，所誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgA應(yīng)答可與口服感染ETEC產(chǎn)生的應(yīng)答相比。當(dāng)斷奶仔豬連續(xù)3天接種口服疫苗并在初免后第16天加強(qiáng)免疫一次，可以完全能預(yù)防口服含F(xiàn)4菌毛的ETEC所致的感染。Joensuu等人建議可用轉(zhuǎn)基因食用苜蓿植物作為F4菌毛粘附和主要亞單位FaeG的載體，這樣既安全又廉價(jià)，但研究表明效果不是很理想[4]。

與菌毛F4相比，當(dāng)用F18大腸桿菌感染時(shí)，口服純化的F18不能誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性的免疫應(yīng)答，當(dāng)F18菌毛劑量達(dá)30mg并聯(lián)合使用粘膜佐劑LT（R139G）也不能產(chǎn)生保護(hù)效果[5]。這兩種菌毛所產(chǎn)生的免疫原性差異可能它們的結(jié)構(gòu)相關(guān)。F18的粘附素是小亞基FedF，然而F4菌毛的粘附素主要菌毛大亞基FaeG。在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)斷奶仔豬口服重組FedF并聯(lián)合使用F4菌毛時(shí)，能減少糞便中F18陽(yáng)性大腸桿菌的排泄。這種聯(lián)合疫苗的研發(fā)開(kāi)啟了一種對(duì)抗F4和F18感染的新途徑[2]。

2 口服活疫苗的應(yīng)用

口服弱毒苗和野生型無(wú)致病大腸桿菌活苗是ETEC疫苗接種的另外一種好的途徑。當(dāng)動(dòng)物口服這些疫苗后，疫苗菌粘附到小腸細(xì)胞觸發(fā)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并迅速產(chǎn)生特異性抗原sIgA抗體，阻止產(chǎn)生同類菌毛的致病性菌的繁殖?？葿ozic等人報(bào)道：在斷奶后的第4天，斷奶仔豬單次口服表達(dá)F4ac的弱毒大腸桿菌后，在第7天不能抵抗強(qiáng)毒力菌株的感染[6]。一種名為Coliprotec的口服活疫苗今年來(lái)相繼在加拿大、巴西、美國(guó)等地開(kāi)始應(yīng)用，這種疫苗可抵抗F4陽(yáng)性ETEC引起的腹瀉。這種疫苗含有天然無(wú)致病力的大腸桿菌，表達(dá)F4粘附素但不產(chǎn)生毒素。臨床實(shí)驗(yàn)證明Coliprotec能很好的抵抗致病性F4陽(yáng)性ETEC的感染且安全性好。F4陽(yáng)性ETEC引起的斷奶后腹瀉（PDW）一般發(fā)生在斷奶后3～10天，因此，從斷奶第1天至發(fā)生有一個(gè)時(shí)間間隔無(wú)法得到保護(hù)。為了避免這種情況，第一次接種最好在哺乳期，但在這個(gè)階段胃腸道存在的哺乳期抗體也許會(huì)影響疫苗株的繁殖甚至免疫失敗。雖然Bertschinger等人在試驗(yàn)中用F18ac陽(yáng)性大腸桿菌疫苗免疫哺乳仔豬（由帶有F18特異性初乳IgA抗體的母豬所產(chǎn)）取得了好的效果，但對(duì)F18ab沒(méi)有起到交叉保護(hù)[2]。另外，在Coddens等人的研究中發(fā)現(xiàn)，日齡10天的仔豬中不表達(dá)或弱表達(dá)F18受體，在這些豬腸道中不太可能有細(xì)菌的繁殖[7]。因此，對(duì)這種疫苗的保護(hù)作用需進(jìn)一步研究。

3 膠囊亞單位活疫苗的應(yīng)用

為了提高活疫苗和亞單位疫苗的效果，膠囊疫苗的應(yīng)用起到了較好的作用。在哺乳期間，膠囊疫苗可以保護(hù)疫苗在胃腸道運(yùn)輸過(guò)程中被母源抗體和其他的乳汁因子（如乳脂球上的受體類似物或乳清等）中和掉。Felder等人檢測(cè)了微型膠囊疫苗的效果，他們將F18陽(yáng)性大腸桿菌和F18菌毛裝在聚丙交酯-乙交酯(PIgA)微球中，通過(guò)噴霧干燥和口服的方法免疫新生仔豬和斷奶仔豬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：口服F18菌毛膠囊疫苗沒(méi)有明顯提高斷奶仔豬的血清抗體應(yīng)答，也不能減少大腸桿菌感染細(xì)菌的繁殖，Verdonckde等人研究中也得到了類似的結(jié)果[2,5,8]。雖然給哺乳仔豬口服F18陽(yáng)性大腸桿菌疫苗能取得較好的效果，但膠囊化的F18陽(yáng)性大腸桿菌在斷奶仔豬和哺乳期仔豬都未能顯著誘導(dǎo)應(yīng)答。

膠囊化的F4菌毛能顯著減少攻毒后F4陽(yáng)性ETEC的分泌，但當(dāng)給哺乳仔豬口服接種F4菌毛培養(yǎng)液時(shí)不能取得這樣的效果，這表明膠囊化對(duì)保護(hù)抗原免受胃和小腸前段中酶的降解和失活或受乳汁因子中和有積極作用的，但需進(jìn)一步優(yōu)化以提高其作用。一種由高直鏈淀粉羥甲基淀粉組成的口服片劑可以用來(lái)傳送F4陽(yáng)性大腸桿菌或純化的F4菌毛，可以使細(xì)菌有更高的成活率并使F4菌毛在胃腸道中更穩(wěn)定?？乖尼尫盘帥Q于片劑從酸性的胃內(nèi)環(huán)境到堿性酶的腸道環(huán)境過(guò)程中的快速膨脹，觸發(fā)快速的溶解。分裝在Gantrez納米中的F4膠囊雖然能提高抗F4血清抗體水平，但與溶解的F4菌毛相比不能提高血清抗體應(yīng)答[9]。

4 注射疫苗的應(yīng)用

由于乳汁母源抗體的存在，可以用注射用免疫對(duì)哺乳仔豬進(jìn)行疫苗。這些疫苗通常只刺激系統(tǒng)免疫而不作用于粘膜免疫系統(tǒng)。在哺乳期間，肌肉注射福爾馬林滅活的F4陽(yáng)性大腸桿菌可導(dǎo)致免疫抑制。經(jīng)肌肉免疫1mg F4菌毛能誘導(dǎo)系統(tǒng)IgA應(yīng)答。當(dāng)疫苗劑量降到0.1mg時(shí)，引起的應(yīng)答反應(yīng)更強(qiáng)，這提示除免疫途徑外，抗原劑量在誘導(dǎo)血清IgA應(yīng)答中也起著很重要的作用。此外，用小規(guī)模無(wú)菌豬進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肌肉注射融合蛋白FaeG-FedF-LT192A2:B可誘導(dǎo)血清、糞便和腸道沖洗物中IgA抗體的產(chǎn)生，這樣可以中和CT，抑制F4和F8的粘附而保護(hù)豬只。融合蛋白的使用可以用來(lái)研發(fā)多價(jià)苗來(lái)抵抗ETEC誘導(dǎo)的斷奶后仔豬腹瀉。維生素D3作為免疫調(diào)節(jié)因子，可以用來(lái)調(diào)節(jié)系統(tǒng)對(duì)腸粘膜IgA的應(yīng)答。聯(lián)合肌肉注射維生素D3和抗原可使派爾集結(jié)淋巴結(jié)中IgA ASC數(shù)量的增加。在第8天和第25天時(shí)用F4菌毛肌內(nèi)免疫哺乳仔豬，在第33天攻毒后能減少糞便排泄物，當(dāng)維生素D3增加時(shí)這種作用更明顯[10]。

5 結(jié)語(yǔ)

ETEC一直是引起斷奶仔豬腹瀉的重要原因，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，其致病與F4或F8密切相關(guān)。當(dāng)感染時(shí)，在小腸中特異的F4和F8 sIgA應(yīng)答可防止細(xì)菌增殖。目前，幾個(gè)口服疫苗包括亞單位苗和口服活苗在斷奶仔豬中取得了較好的效果。由于F4陽(yáng)性ETEC引起仔豬腹瀉一般發(fā)生在斷奶后的3～10天，因此在哺乳期間免疫更理想。膠囊化的亞甲基苗和口服活疫苗可以克服疫苗在胃腸道中被降解，還可防止被母源抗體和/或其他乳汁因子中和，但目前應(yīng)用效果不佳。用注射用疫苗是另外一種可行的預(yù)防途徑，但用于母豬的注射用疫苗傾向于刺激全身的而不是局部粘膜免疫系統(tǒng)。雖然注射免疫后可誘導(dǎo)系統(tǒng)的IgA應(yīng)答和腸道IgA抗體產(chǎn)生，但在ETEC感染時(shí)，有效的ETEC免疫通常也需要GALT中特異性抗體IgA ASC的存在。維生素D3作為一種免疫調(diào)節(jié)因子在小鼠中取得了好的效果，但當(dāng)應(yīng)用于哺乳仔豬時(shí)并沒(méi)有獲得保護(hù)性的粘膜免疫。因此，在注射免疫中，膠囊化的活疫苗和免疫調(diào)節(jié)劑的聯(lián)合使用可以克服哺乳期注射疫苗帶來(lái)的問(wèn)題，但仍需進(jìn)一步的研究。□

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S858.28

A

1006-4907（2014）03-0001-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2014.03.001

楊佳亮(1990～），女，在讀碩士，主要從事重大疫病防控工作，E-mail∶YJL900521@126.com。※ 通訊作者：楊青，qingyanghn@hunau.edu.cn。

2014-03-15