結(jié)核病兔模型的建立應(yīng)用及其研究現(xiàn)狀

柯常江，馮起校，李富浩

(中山市陳星海醫(yī)院廣東醫(yī)學(xué)院附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東中山 528415)

·綜述·

結(jié)核病兔模型的建立應(yīng)用及其研究現(xiàn)狀

柯常江，馮起校，李富浩

(中山市陳星海醫(yī)院廣東醫(yī)學(xué)院附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東中山 528415)

結(jié)核病的發(fā)病人數(shù)之多、流行范圍之廣、致死率之高，是當(dāng)今世界傳染病預(yù)防治療的難題之一。復(fù)制出人類結(jié)核病的動物模型已經(jīng)成為研究結(jié)核病的重要工具。為了解結(jié)核病兔模型研究概況，本文對結(jié)核病兔模型動物品種品系的選擇、造模方法、應(yīng)用范圍等做一簡要分析。

感染；動物模型；結(jié)核??；綜述

根據(jù)世界衛(wèi)生組織流行病學(xué)調(diào)查表明，世界上約三分之一的人口曾不同程度感染上結(jié)核分枝桿菌，其中百分之十左右發(fā)展成為結(jié)核病，全球感染患者人數(shù)每年超過800萬，其中死于結(jié)核病約300萬人左右；結(jié)核病已成為當(dāng)今世界由一種病原菌引起的疾病當(dāng)中死亡患者最多的傳染病之一，我國約有超過100萬結(jié)核病患者，位居世界第二位，是全球結(jié)核病高發(fā)病率的國家之一[1]。因此，建立一個合理的動物模型對于深入研究結(jié)核病病因、機制、病理過程、機體免疫反應(yīng)、診斷、藥物治療及新疫苗開發(fā)等具有重要的意義。本文對結(jié)核病兔模型動物品種品系選擇、感染途徑、感染方法、感染劑量、菌株毒力及其應(yīng)用范圍做一簡要概述。

1 實驗兔的品種及品系的選擇

選擇實驗動物模型兔子品種及品系在實驗研究當(dāng)中非常重要。目前我國常用的品種主要有中國白兔、青紫蘭兔、日本大耳白兔、新西蘭白兔等，其中新西蘭白兔最為常用。2004年Dorman等[2]發(fā)現(xiàn)通過氣溶膠途徑用H37Rv或Erdman株結(jié)核桿菌分別對新西蘭白兔遠(yuǎn)交系和近交系進(jìn)行感染并比較。感染后第5周，近交系兔子比遠(yuǎn)交系兔子出現(xiàn)更大的肺結(jié)核病灶。用人型結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株感染后，近交系兔子比遠(yuǎn)交系兔子出現(xiàn)更多的肺結(jié)核病灶并且每個病灶當(dāng)中結(jié)核分枝桿菌的集落形成單位也明顯較多。比較二者的組織學(xué)，近交系兔子出現(xiàn)更多的干酪樣壞死及活菌數(shù)量，但上皮細(xì)胞卻極少。因此，表明近交系兔子比遠(yuǎn)交系兔子對結(jié)核分枝桿菌更加敏感。在2005年Gupta等[3]利用該模型比較近交兔子與遠(yuǎn)交兔子對結(jié)核分枝桿菌的敏感性和抗性發(fā)現(xiàn)兩者存在較大的不同：遠(yuǎn)交兔子對結(jié)核分枝桿菌的敏感性和抗性存在明顯的個體差異，而近交兔子難以獲得。

2 常見結(jié)核病兔模型

2.1 肺結(jié)核兔模型1996年，Converse等[4]成功制作出空洞型肺結(jié)核兔模型，第一次描述并分析了肺結(jié)核空洞形成的完整過程。利用兩個不同劑量組的牛型結(jié)核分枝桿菌菌株通過氣溶膠途徑感染新西蘭白兔，分別吸入220～880個分枝桿菌單位和吸入3 900～5 800個分枝桿菌單位，兩組均可以發(fā)展成為結(jié)核典型病灶，如液化壞死和肺結(jié)核空洞。肺結(jié)核空洞最早出現(xiàn)在感染后第6周，在第33周肺部病變?nèi)杂幸夯案衫覊乃溃渫庵苡写罅坷w維包裹。筆者還發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶D在干酪樣壞死、液化及空洞形成的過程中起著重要的作用。2009年，Nedeltchev等[5]使用103～104CFU/0.3 ml劑量的結(jié)核分枝桿菌CDC1551、牛分枝桿菌AF2122、BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv通過支氣管鏡接種于致敏的新西蘭白兔右肺基底段。感染后6～15周均可以產(chǎn)生明顯的結(jié)核空洞。牛分枝桿菌AF2122感染兔子的肺空洞液化組織可培養(yǎng)出桿菌數(shù)最高在106～109CFU，而其他三組介于104～108CFU之間。所有的動物都可發(fā)生肺部結(jié)核結(jié)節(jié)樣病變，但牛分枝桿菌AF2122感染引起的結(jié)核結(jié)節(jié)樣病理改變及肺外播散最為明顯。這種獨特空洞模型為結(jié)核空洞的發(fā)病機制及肺外播散研究提供了基礎(chǔ)。2011年，Subbian等[6]使用結(jié)核分枝桿菌HN878菌珠通過氣溶膠途徑感染新西蘭白兔，動物肺部出現(xiàn)一系列結(jié)核病理過程，如干酪樣壞死、液化及肺部組織能培養(yǎng)出結(jié)核桿菌，從而成功制作出肺結(jié)核模型，通過此模型用于研究磷酸二酯酶-4抑制劑CC-3052聯(lián)合異煙肼可以提高肺結(jié)核的治療效果。

2.2 結(jié)核病潛伏期兔模型Manabe等[7-8]使用104～106CFU劑量人型結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株通過氣溶膠途徑感染新西蘭白兔，感染后第5周所有兔子肺部組織的帶菌量可達(dá)到峰值，右上肺葉勻漿培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌量可達(dá)到2.07×103～2.8×104CFU，而且第36周1/3的兔子體內(nèi)仍有至少1個帶活菌的干酪樣肉芽腫。若感染后第5周進(jìn)行糖皮質(zhì)激素免疫抑制，通過觀察發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌素實驗反應(yīng)、肺部干酪樣結(jié)節(jié)及結(jié)核桿菌數(shù)量增加、CD4+及CD8+T細(xì)胞減少，這樣可使結(jié)核分枝桿菌被重新激活，其中發(fā)展成為免疫重建炎癥綜合征兔模型的比例高達(dá)50%。此模型屬于結(jié)核病潛伏期模型，可用于研究免疫發(fā)病機制及提高疾病各階段的診斷將具有重要作用。Subbian等[9-10]通過氣溶膠途徑將(1.08±0.31)×103CFU結(jié)核分枝桿菌CDC1551感染新西蘭白兔，在感染后第4周感染兔子的肺勻漿培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌量達(dá)到峰值(3.0±1.3)×105CFU，以后持續(xù)下降至第24周時肺勻漿培養(yǎng)全為陰性。如果使用糖皮質(zhì)激素可以誘導(dǎo)結(jié)核復(fù)發(fā)，肺勻漿培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌再次出現(xiàn)陽性并持續(xù)升高一段時間。這表明肺部組織內(nèi)仍有極少部分結(jié)核分枝桿菌呈現(xiàn)出潛伏狀態(tài)，當(dāng)免疫力抑制時可以重新激活。這種自發(fā)潛伏性結(jié)核病模型為結(jié)核病分子免疫機制研究奠定了基礎(chǔ)。

2.3 結(jié)核分枝桿菌所致家兔皮膚液化病理模型Zhang等[11]在新西蘭白兔皮內(nèi)分別注射5× 102CFU/ml、5×104CFU/ml、5×106CFU/ml恥垢分枝桿菌菌液、H37Ra和BCG，第6周在病灶周圍第二次皮內(nèi)注射相同劑量，第8周在明顯病灶處做病理組織檢查，最明顯的膿腫液化、壞死、破潰等病理改變出現(xiàn)在5×106CFU/ml劑量組。BCG引起結(jié)核病變最為嚴(yán)重，病變最輕的是恥垢分枝桿菌。典型的結(jié)核性肉芽腫可以在顯微鏡下觀察到。在結(jié)核病灶處的細(xì)菌抗酸染色當(dāng)中所有動物兔子檢測結(jié)果都呈陽性。再次免疫后中、低劑量組的BCG不引起液化壞死潰瘍，但可以出現(xiàn)較輕的炎癥反應(yīng)和較小結(jié)核結(jié)節(jié)，其余低、中劑量組未見到明顯結(jié)核病理改變。結(jié)核分枝桿菌皮內(nèi)注射家兔皮膚模型，可用于結(jié)核性肉芽形成、繼而發(fā)生液化壞死、藥物篩選和新疫苗開發(fā)等方面的研究。此模型操作簡單、快速、直觀、成本較低，還有利于家兔使用范圍的推廣。

2.4 骨關(guān)節(jié)結(jié)核兔模型劉正文等[12]先將明膠海綿吸附結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株懸液(0.5 mg/0.1 ml)，再將其填充在無致敏新西蘭白兔L5上方的椎間盤處鉆骨孔內(nèi)。結(jié)核菌感染后發(fā)現(xiàn)，兔子全身反應(yīng)較輕，局部反應(yīng)較明顯。感染組12只兔子中9只順利完成實驗，3只出現(xiàn)納差和消瘦；術(shù)后1個月有2只兔子出現(xiàn)X線陽性，術(shù)后2個月有4只兔子X線陽性，術(shù)后2個月有7只兔子MRI陽性，術(shù)后2個月6只兔子CT陽性。對感染組陽性兔子的椎旁軟組織及椎體做病理切片可以觀察到有類上皮樣細(xì)胞、膿細(xì)胞及壞死病灶等形成，感染組陽性兔子病灶明顯處取膿液做細(xì)菌培養(yǎng)顯示60.0%結(jié)核分枝桿菌生長。根據(jù)術(shù)后2個月6只兔子CT陽性推算出建立此模型有66.7%的成功率。因此，將合適劑量和濃度的結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株種植在未致敏的新西蘭白兔脊柱椎體局部，制作出兔脊柱結(jié)核動物模型的病理變化與人類脊柱結(jié)核非常相似。此模型盡管手術(shù)建立的脊柱結(jié)核動物模型，在發(fā)病機制上與人類脊柱結(jié)核尚有一定差異，但仍為目前較為可行的應(yīng)用于脊柱結(jié)核相關(guān)研究的實驗載體。對于早期診斷脊柱結(jié)核有些學(xué)者利用脊柱結(jié)核動物模型進(jìn)行分析磁共振彌散加權(quán)成像(DWI)及測量AD值可以獲得一定信息[13]。李萬里等[14]使用l×107CFU/ml H37Rv結(jié)核桿菌懸液0.2 ml對新西蘭白兔膝關(guān)節(jié)囊進(jìn)行注射感染。第4周發(fā)現(xiàn)，家兔膝關(guān)節(jié)逐漸腫脹；X線攝片檢查顯示膝關(guān)節(jié)囊有腫脹；磁共振檢查顯示關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹，關(guān)節(jié)腔積液；病理檢查可見結(jié)核病灶；滑膜組織培養(yǎng)有結(jié)核桿菌生長；說明已成功制作出新西蘭白兔膝關(guān)節(jié)滑膜結(jié)核模型。此種模型構(gòu)建的方法簡單，成功率高，重復(fù)性強，組內(nèi)病變程度較一致，為膝關(guān)節(jié)結(jié)核的病理學(xué)及藥效學(xué)的動物實驗研究奠定了一定基礎(chǔ)。2002年，吳啟秋等[15]在家兔膝關(guān)節(jié)腔注入0.5 mg/0.1 ml牛型分支桿菌，成功建立兔膝關(guān)節(jié)結(jié)核模型。畢龍等[16]在實驗前對大耳白兔進(jìn)行結(jié)核菌素純化蛋白(PPD)試驗陰性作為模型動物，再皮內(nèi)注射1 ml BCG使動物致敏，然后對已經(jīng)在動物股骨內(nèi)髁松質(zhì)骨內(nèi)造好的隧道內(nèi)注射大劑量結(jié)核因子(包括完全佛氏佐劑0.5 ml、皮內(nèi)注射用卡介苗0.5 ml、300 μg/ml Mt Sonicate 0.5 ml)，由此引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)及骨質(zhì)破壞，可以從動物大體變化、病理組織學(xué)、放射學(xué)(X線片)來觀察免疫性骨結(jié)核模型的變化?？梢悦黠@的觀察到，結(jié)核因子注射部位出現(xiàn)骨髓腔內(nèi)的破骨細(xì)胞增殖、骨吸收破壞、大量單核巨噬細(xì)胞浸潤及干酪樣壞死。因此根據(jù)骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病過程成功的制作出兔免疫性骨結(jié)核模型。此模型能替代活結(jié)核桿菌建立的動物模型并且可以模擬骨結(jié)核的病理特點。本模型構(gòu)建的方法簡單，重復(fù)性強，成功率高。

2.5 結(jié)核性腦膜炎兔模型2007年Tsenova等[17]利用新西蘭白兔成功的制作出結(jié)核性腦膜炎模型。方法：在動物麻醉后，通過脊髓穿刺針進(jìn)入小腦延髓池注入5×105CFU結(jié)核分枝桿菌H37Rv或HN878，通過腦脊液檢測培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)體征及大腦組織病理學(xué)觀察都出現(xiàn)結(jié)核樣改變，通過此模型來研究BCG對結(jié)核分枝桿菌H37Rv及HN878免疫保護(hù)效能評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCG對H37Rv及HN878感染都有免疫保護(hù)力，但對H37Rv感染免疫保護(hù)力最強。雖然BCG具有免疫保護(hù)力，但卻不能阻止兔子體重減輕，也不能阻止大腦和肺臟病變及癥狀的出現(xiàn)，同時也阻止不了結(jié)核桿菌向肝臟、脾臟、腎臟擴散。因此研究者建議，當(dāng)運用動物模型來檢驗新疫苗的保護(hù)力時，不僅要用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株，同時還要用不同臨床分離菌株比如北京株。他們利用此模型，進(jìn)行評估重組融合聚Mtb72F加AS02A、BCG(卡介苗)及重組融合聚Mtb72F加AS01B三者之間的免疫保護(hù)作用。最后得出結(jié)論：免疫力保護(hù)功效程度依次為重組融合聚Mtb72F加AS01B增強于重組融合聚Mtb72F加AS02A，后者又強于BCG[18]。因此，可以用于結(jié)核疫苗方面的研究。同時他們還利用結(jié)核性腦膜炎兔模型，表明了結(jié)核分枝桿菌H37Rv與結(jié)核分枝桿菌HN878和W4（W北京基因型）相比菌株毒力較弱[19]。

2.6 其他類型及應(yīng)用Jassal等[20]通過支氣管鏡途徑將103～104CFU牛分枝桿菌分別感染致敏和末致敏的新西蘭白兔，對照觀察兔子體重、結(jié)核菌素試驗、肺部CFU數(shù)、肺部及肝脾腎的病理變化（如結(jié)核結(jié)節(jié)的數(shù)量）等，進(jìn)一步對評價結(jié)核性兔模型大體病理評分系統(tǒng)(Gross scoring system)制定與完善。楊奇等[21]實驗動物選用日本大耳白兔，一組經(jīng)動物耳靜脈直接注射107/1 ml H37Rv菌懸液，一組動物免疫器官功能被鈷-60輻射破壞后耳靜脈注射H37Rv菌懸液(107/ml)。3周后處死動物，內(nèi)臟器官做病理組織切片經(jīng)BCG免疫組織化學(xué)染色、MCT(三色)染色、HE染色、Z-N染色及電鏡觀察。結(jié)果顯示，動物心肌和冠狀動脈均可以觀察明顯結(jié)核病變，而且免疫功能低下動物易于感染結(jié)核并較為嚴(yán)重。本實驗以家兔作為動物模型來探討結(jié)核桿菌能否導(dǎo)致冠狀動脈的病理性損傷。

3 結(jié)語

肺結(jié)核兔模型為結(jié)核空洞的發(fā)病機制、病理形成過程、肺外播散及藥物治療提供研究基礎(chǔ)。結(jié)核病潛伏期兔模型對于研究免疫發(fā)病機制、結(jié)核病階段性診斷、藥物抗持留結(jié)核分枝桿菌的功效上有著比較重要的作用。皮膚結(jié)核兔模型對于模擬人肺部的干酪樣壞死和液化，比較不同結(jié)核分枝桿菌的毒力、藥物篩選和新疫苗開發(fā)等方面的研究具有一定的優(yōu)勢。骨關(guān)節(jié)結(jié)核兔模型對研究骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病機制、病理學(xué)及治療療效等奠定了一定基礎(chǔ)。結(jié)核性腦膜炎兔模型是一個非常有用的工具，對評估菌株毒力、疾病進(jìn)展和病理以及測試新的候選疫苗療效也具有明顯的作用。一個好的疾病動物模型應(yīng)具有：(1)生命周期能夠滿足實驗需要，并且動物遺傳背景資料完整；(2)再現(xiàn)性好，也就是可以模擬人類的疾??；(3)專一性強；(4)復(fù)制率高。根據(jù)結(jié)核病的研究內(nèi)容不同，需要綜合考慮菌株毒力[22]、感染途徑[23]、感染部位、感染劑量、感染動物免疫力等，建立滿足實驗需要的結(jié)核病模型。

[1]Okada M,Kobayashi K.Recent progress in mycobacteriology[J]. Kekkaku,2007,82(10):783-799．

[2]Dorman SE,Hatem CL,Tyagi S,et al.Susceptibility to tuberculosis:clues from studies with inbred and outbred New Zealand white rabbits[J].Infect Immun,2004,72:1700-1705.

[3]Gupta UD,Katoch VM.Animal models of tuberculosis[J].Tuberculosis,2005,85(5-6):277-293.

[4]Converse PJ,Dannenberg AM,Estep JE,et al.Cavitary tuberculosis produced in rabbits by aerosolized virulent tubercle bacilli[J].Infect immune,1996,64(5):4776-4787.

[5]Nedeltchev GG,Raghunand TR,Jassal MS,et al.Extrapulmonary dissemination of mycobacterium bovis but not mycobacterium tuberculosis in a bronchoscopic rabbit model of cavitary tuberculosis [J].Infect Immun,2009,77(2):598-603.

[6]Subbian S,Tsenova L,Brien PO,et a1.Phosphodiesterase-4 inhibition combined with isoniazid treatment of rabbits with pulmonary tuberculosis reduces macrophage activation and lung pathology[J]. Pathol,2011,179(1):289-301.

[7]Manabe YC,Kesavan AK,Lopez-Molina J,et a1.The aerosol rabbit model of TB latency,reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome[J].Tuberculosis,2008,88(3):187-196．

[8]Manabe YC,Dannenberg AM,Tyagi SK,et a1.Different Strains of Mycobacterium tuberculosis Cause Various Spectrums of Disease in the Rabbit Model of Tuberculosis[J].Infect immune,2003,71(10): 6004-6011．

[9]Subbian S,Tsenova L,O'Brien P,et al.Spontaneous latency in a rabbit model of pulmonary tuberculosis[J].Pathol,2012,181(5): 1711-1724.

[10]Subbian S,O'Brien P,Kushner NL,et al.Molecular immunologic correlates of spontaneous latency in a rabbit model of pulmonary tuberculosis[J].Cell Communication and Signaling,2013,11:1-16.

[11]Zhang G,Zhu B,Shi W,et a1.Evaluation of mycobacterial virulence using rabbit skin liquefaction mode1[J].Virulence,2010,1 (3):156-163．

[12]劉正文,宋興華.建立新西蘭白兔脊柱結(jié)核模型的實驗研究[D].新疆醫(yī)科大學(xué),2012.

[13]劉瑩,王云玲,王紅,等.MR彌散加權(quán)成像在兔脊柱結(jié)核早期診斷中的應(yīng)用價值[J].磁共振成像,2011,2(6):435-438.

[14]李萬里,宋躍明.異煙肼緩釋微球治療家免膝關(guān)節(jié)滑膜結(jié)核的實驗研究[D].四川大學(xué),2006.

[15]吳啟秋,段連山,梁桂芳,等.兔膝關(guān)節(jié)結(jié)核模型的建立及其應(yīng)用[J].結(jié)核病與胸部腫瘤雜志,2002,3:174-176.

[16]畢龍，胡蘊玉.骨關(guān)節(jié)結(jié)核的相關(guān)實驗研究[D].第四軍醫(yī)大學(xué)，2007.

[17]Tsenova L，Harbacheuski R，Sung N，et a1.BCG vaccination confers poor protection against M.tuberculosis HN878-induced central nervous system disease[J].Vaccine，2007，25：5126-5132.

[18]Tsenova L,Harbacheuski R,Moreira AL,et al.Evaluation of the Mtb72F polyprotein vaccine in a rabbit model of tuberculous meningitis[J].Infect Immun,2006,74(4):2392-2401.

[19]Tsenova L,Ellison E,Harbacheuski R,et al.Virulence of selected Mycobacterium tuberculosis clinical isolates in the rabbit model of meningitis is dependent on phenolic glycolipid produced by the bacilli[J].Infect Dis,2005,192(1):98-106.

[20]Jassal MS，Nedehchev GG,Osborne J,et a1．A modified scoring system to describe gross pathology in the rabbit model of tuberculosis[J].BMC Microbiol，201l,11(1):49．

[21]楊奇,盧潤生,蔣紹雙,等.急性結(jié)核菌感染所致冠狀動脈損害的實驗研究[J].中國防癆雜志,1999,21(4):191-193.

[22]Walsh GP,Tan EV,dela Cruz EC,et al.The Philippine cynomolgus monkey(Macaca fasicularis)provides a new nonhuman primate model of tuberculosis that resembles human disease[J].Nat Med, 1996,2:430-436.

[23]漆浩珊,盧潤生,楊奇,等.不同毒力菌株與感染途徑在樹造結(jié)核動物模型中的作用[J].四川醫(yī)學(xué),1997,18(3)：150-152.

R-332

A

1003—6350（2014）03—0369—04

2013-07-25)

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.03.0142

廣東省科學(xué)技術(shù)廳社會發(fā)展領(lǐng)域科技資助項目(編號：20120318095)

馮起校。E-mail：cxhfqx@163.com