中藥在腫瘤細(xì)胞凋亡途徑方面的研究進(jìn)展

姜 冀 宋央央 舒琦瑾

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)·杭州 310053）

細(xì)胞凋亡( apoptosis) 是指細(xì)胞在一定的生理及病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程，最后細(xì)胞裂解為若干凋亡小體，被其他細(xì)胞吞噬?，F(xiàn)在很多情況下，亦稱為程序性細(xì)胞死亡(Programmed Cell Death, PCD）。目前一般認(rèn)為, 腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅是細(xì)胞增殖失控和細(xì)胞分化異常的結(jié)果, 同時(shí)也與腫瘤細(xì)胞凋亡失衡有關(guān)[1]。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡成為了惡性腫瘤治療中的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。但由于化療藥物對腫瘤細(xì)胞選擇性較差，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也殺死正常細(xì)胞，且其毒副作用大，因此從天然產(chǎn)物中尋找高效低毒的抗腫瘤藥物，已成為抗腫瘤藥物研究的重要組成部分。然而細(xì)胞凋亡的途徑復(fù)雜，在不同環(huán)境、不同細(xì)胞或不同刺激的情況下，細(xì)胞凋亡的途徑是不同的，而且細(xì)胞凋亡的信號途徑具有多樣性，這使得凋亡的發(fā)生及調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜。一般認(rèn)為，細(xì)胞凋亡存在三條主要通路：線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路，各通路間互相聯(lián)系，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[2]。本文僅對中藥在腫瘤細(xì)胞凋亡此三條通路方面的研究進(jìn)展做一總結(jié)。

1 細(xì)胞凋亡途徑

1.1 線粒體途徑

線粒體不僅是細(xì)胞內(nèi)主要的 ATP 生產(chǎn)中心，其在細(xì)胞凋亡的過程中也起著非常重要的作用。在凋亡信號的刺激下，線粒體膜電位會丟失，線粒體的通透性會發(fā)生變化，存在于線粒體內(nèi)外膜間的細(xì)胞色素C和其他蛋白遇凋亡刺激會從線粒體內(nèi)釋放到細(xì)胞漿或細(xì)胞核中，引起caspase 9的活化裂解，活化的caspase 9激活了下游的caspase 3，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

1.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，參與體內(nèi)的多種細(xì)胞進(jìn)程，包括維持細(xì)胞內(nèi)的鈣離子穩(wěn)態(tài)、合成和傳輸?shù)鞍踪|(zhì)以及合成一些重要脂類等，這些進(jìn)程對于維持細(xì)胞存活和發(fā)揮細(xì)胞的正常生理功能具有重要的作用[3]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+的聚集已經(jīng)被證實(shí)是促凋亡的機(jī)制之一[4]，這種聚集主要來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放，相對高濃度Ca2+的可以激活胞質(zhì)中的鈣依賴性蛋白酶，又可以作用于線粒體，影響其通透性并導(dǎo)致其膜電位的改變，從而促進(jìn)凋亡[5]。Bcl-2家族蛋白可調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流，其中的Bad、Bax蛋白可促進(jìn)鈣離子的內(nèi)流，而過度表達(dá)的Bcl-2，Bcl-XL則會阻止這一過程[6、7]。

1.3 死亡受體途徑

死亡受體為一類跨膜蛋白，可以將胞外的死亡信號轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，屬腫瘤壞死因子受體(TNFR)基因超家族。已知的死亡受體有五種，TNFR-1(又稱CD120a或p55)，F(xiàn)as(CD95或Apo1)，DR3(死亡受體3，又稱Apo3，WSL-1，TRAMP，LARD)，DR4和DR5(Apo2，TRAIL-R2，TRICK2，KILLER)。激活死亡受體通路的已知配體包括TNF-α，F(xiàn)asL和TRAIL。Fas介導(dǎo)凋亡先由死亡受體的活化開始，F(xiàn)as被FasL或其他啟動因子激活后會導(dǎo)致3個(gè)死亡受體分子交聯(lián)形成三聚體，募集的接頭蛋白(Fas-associated death domain protein，F(xiàn)ADD)直接與胞內(nèi)的DD結(jié)合，實(shí)現(xiàn)Fas的寡聚化。FADD又通過N末端的DED結(jié)合pro-caspase 8的DED，形成Fas-FasL-FADD-procaspase，稱為死亡信號復(fù)合體DISC(deathinducing signaling complex)。DISC中的pro-caspase-8發(fā)生自身裂解轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂写呋钚缘男问?，從而直接激活下游的caspase 3效應(yīng)因子，發(fā)生細(xì)胞凋亡[7、8]。TNF與TNFR-1結(jié)合可激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和激活蛋白AP 1，誘導(dǎo)促炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。在一些細(xì)胞中，TNF也可以通過與TNFR-1結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在DR4或DR5介導(dǎo)的凋亡活動中，TRAIL黏附于DR4或DR5上導(dǎo)致了受體三聚化并組成了死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(DISC)，DISC可以激活caspase8。后續(xù)的活動亦可以分為兩種凋亡信號途徑，在第一途徑中caspase8直接激活caspase3、6、7，經(jīng)外源性途徑誘導(dǎo)凋亡；在第二途徑中caspase8通過激活Bid與線粒體連接，激活內(nèi)源途徑誘導(dǎo)凋亡[9]。

1.4 三條途徑間的相互聯(lián)系

線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路之間存在著密切的聯(lián)系。Boehning等的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞色素C可以結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的InsP3R 上促進(jìn)鈣的釋放[10]。死亡受體通路激活的caspase 8通過第二途徑可激活bid，活化的bid可促進(jìn)bax的寡聚化，誘導(dǎo)線粒體中細(xì)胞色素C及其他蛋白釋放，從而引起細(xì)胞凋亡。而DR5水平的上調(diào)有時(shí)也依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的JNK和p38 MAPK的活化[11]。這三條通路最后都有caspase的激活，這說明caspase是三條通路調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在腫瘤細(xì)胞凋亡研究中的現(xiàn)狀

從20世紀(jì)80年代以來，凋亡一直都是腫瘤病因?qū)W、病理學(xué)研究的熱點(diǎn)，隨著對凋亡機(jī)制的深入了解，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為抗腫瘤治療的重要組成部分。在傳統(tǒng)研究過程中，人們探討細(xì)胞凋亡主要圍繞著線粒體途徑及死亡受體途徑進(jìn)行，近年來，人們把更多的目光放在了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路途徑的研究上，并取得了一定的進(jìn)展。目前，已知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑有3條：(1)CHOP／GADD153基因的激活轉(zhuǎn)錄；(2)JNK的激活通路；(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的Caspase12的激活通路[12]。此外人們還發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)凋亡抑制蛋白家族中的Survivin基因在對細(xì)胞凋亡的這三條途徑都具有抑制作用，對非caspase依賴細(xì)胞凋亡的途徑也有抑制作用，可以說它迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的細(xì)胞凋亡抑制因子。因此，降低Suvivin蛋白的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞凋亡有著極其深刻的意義[13]。

3 中藥在腫瘤細(xì)胞凋亡研究中的進(jìn)展

中藥治療與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)一樣，是通過藥物與各信號通路上的靶點(diǎn)結(jié)合引起細(xì)胞凋亡的。在早期的研究中，人們多通過在電鏡和光鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)的改變及凋亡小體的出現(xiàn)判斷中藥是否能引起細(xì)胞凋亡，后來人們開始運(yùn)用MTT及流式細(xì)胞儀檢測中藥對腫瘤細(xì)胞的增殖作用的影響及對細(xì)胞周期的影響。隨著研究的深入，人們開始在凋亡機(jī)制上對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行研究，并通過PCR、Western Blot等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行論證。

（1）在線粒體途徑的研究中，林宇[14]等人將巖大戟內(nèi)酯B作用于人乳腺癌Bcap37細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可顯著降低線粒體膜電位，從而啟動線粒體凋亡途徑。

（2）在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的研究中，陳培豐[15]等人發(fā)現(xiàn)蛇六谷石油醚萃取物可下調(diào)人胃癌SGC-7901 細(xì)胞及小鼠H22肝癌移植瘤的Bcl- 2蛋白的表達(dá)同時(shí)上調(diào)bax蛋白、Cleaved-Caspase -9 蛋白酶的表達(dá)。候賀佳[16]等人則發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白誘導(dǎo)卵巢癌H08910細(xì)胞凋亡與其抑制Bcl-2蛋白、激活Bax蛋白有密切關(guān)系。而五行湯和槲寄生提取物的抗腫瘤作用則與其升高腫瘤細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載的作用有著密切關(guān)系[17、18]。

（3）在死亡受體途徑的研究中，威靈仙多糖和胃痞顆粒均已被證實(shí)可通過上調(diào)Fas的水平及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[19、20]。吳瓊[21]等人則證實(shí)了健脾解毒方對裸鼠人胃癌細(xì)胞的凋亡作用與其可以促進(jìn)死亡受體通路中Fas、TNF-α、TNF-β的表達(dá)有著密切關(guān)系。沈海山[22]等發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素可以通過Apo2L/TRAIL-Caspase-8和Fas/fasL-線粒體-Caspase-9 途徑激活Caspase 家族，導(dǎo)致T24 細(xì)胞凋亡，這不僅證實(shí)了死亡受體在細(xì)胞凋亡中的作用，同時(shí)也說明caspase9可能是Fas誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)分子之一。

3.4 在對姜黃素的研究中，人們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放導(dǎo)致線粒體中Ca2+濃度的改變是促使細(xì)胞色素C釋放的重要步驟[23]，這說明姜黃素對細(xì)胞凋亡的作用是多途徑的。

近年來，人們的研究開始進(jìn)一步深入到藥物作用的信號通路或者是某一具體靶點(diǎn)。吳勉華[24]等人發(fā)現(xiàn)消癌解毒方加入脂多糖及CD284后能作用于人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的TLRs/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的異常持續(xù)活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

4 討論

這些研究結(jié)果向我們展示了中藥在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面的思路和成果，而對信號通路的研究使中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與西方醫(yī)學(xué)更好的銜接在一起。我們可以看到中藥對腫瘤細(xì)胞凋亡的作用是多系統(tǒng)、多途徑、多靶點(diǎn)進(jìn)行的，同一種中藥對不同系統(tǒng)的腫瘤，對腫瘤細(xì)胞凋亡的各個(gè)途徑，對凋亡途徑的各個(gè)靶點(diǎn)均有療效。因此，中藥治療已經(jīng)成為惡性腫瘤治療過程中一個(gè)不可缺少的組成部分。但是我們也必須看到目前在中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡研究中存在的局限性。其一、我們現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)一般都局限在離體實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)，臨床實(shí)驗(yàn)相對較少。其二，研究的對象以中藥某一成分或部分提取物為主，不能夠全面反映某一中藥本身成分的復(fù)雜性。其三、對中藥復(fù)方制劑的作用機(jī)制研究無突破性的進(jìn)展,絕大多數(shù)研究仍停留在電鏡和光鏡下，缺乏進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究的支撐。

惡性腫瘤的發(fā)生是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，加上患者個(gè)體的差異，其病情進(jìn)展和臨床表現(xiàn)也多有差別。中藥在惡性腫瘤治療過程中的優(yōu)勢就在于可以給患者提供個(gè)體化治療，辯證施治，因此加強(qiáng)對中藥復(fù)方制劑研究的技術(shù)力量對于惡性腫瘤的治療有著長遠(yuǎn)的影響。

[1]歐陽高亮,李祺福. 細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療[M].國外醫(yī)學(xué)·腫瘤學(xué)分冊 2000,(5):266-269

[2]Kwak CS,Yeo EJ,Moon SC,et al.Perilla leaf, Perilla frutescens, induces apoptosis and G1 phase arrest in human leukemia HL-60 cells through the combinations of death receptor-mediated, mitochondrial,and endoplasmic reticulum stress-induced pathways[J].Journal of medicinal food,2009,(3):508-517.

[3]Anelli T,Sitia R．Protein quality control in the early secretory pathway[J]．EMBO J,2008,(2):315－327．

[4]MP Mattson, SL Chan.Calcium orchestrates apoptosis[J].Nat.Cell Biol,2003,(05):1041–1043.

[5]Matthew A Smith,Rick G Schnellmann.Calpains mitochondria and apoptosis[J].Cardiovascular Research,2012,(5):32-37.

[6]Bing Yu,et al.Expression of the apoptosis-related genes BCL-2 and BAD in human breast carcinoma and their associated relationship with chemosensitivity[J]. Journal of Experimental &Clinical Cancer Research.2010,29:107.

[7]SW Han,J Roman.Targeting Apoptotic Signaling Pathways in Human Lung Cancer[J].Current Cancer Drug Targets.2010,(10):566-574.

[8]TS Gomes,et al.The extrinsic apoptotic signaling pathway in gastric adenocarcinomas assessed by tissue microarray[J].Pathology—Research and Practice,2011,(207):613-617.

[9]Kristina Viktorsson,et al.Apoptotic Signaling Pathways in Lung Cancer[J].J Thorac Oncol,2007,(2): 175–179.

[10]Boehning D，et al. Cytochrome c binds to inositol (1,4,5)trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis[J].Nat Cell Biol, 2003,(5): 1051-1061.

[11]Sook Kyung Park,et al.Tocotrienols induce apoptosis in breast cancer cell lines via an endoplasmic reticulum stress-dependent increase in extrinsic death receptor signaling[J].Breast Cancer Res Treat,2010(2):361–375.

[12]Aruljothi Subramaniam, Ser Yue Loo,et al.An anthraquinone derivative, emodin sensitizes hepatocellular carcinoma cells to TRAIL induced apoptosis through the induction of death receptors and downregulation of cell survival proteins[J].Apoptosis,2013(10)

[13]KAUFMAN R J．Orchestrating the unfolded protein response in health and disease[J]．J Clin Invest，2O02，110(10)：1389—1398.

[14]林宇,崔紅霞,許惠玉等. 巖大戟內(nèi)酯B對人乳腺癌Bcap37細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中國新藥雜志,2012,(7):780-783.

[15]陳培豐,常中飛,吳巧鳳等.蛇六谷乙酸乙酯部位抗癌化學(xué)成分研究[J]. 中華中醫(yī)藥雜志,2013,(2):497-499.

[16]候賀佳,張爽. 天花粉蛋白對卵巢癌HO8910細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2基因表達(dá)的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志,2011,(9):1729-1730.

[17]莫非,胡晶瑩,甘愉等.五行湯抗腫瘤及經(jīng)鈣離子介導(dǎo)的促腫瘤細(xì)胞凋亡作用[J].中藥材,2008,(9):1368-1372.

[18]王鵬雁,安建多,王池等.槲芪散及槲寄生提取物對肝癌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,(3):291-296.

[19]楊旭東,張杰,王桂云. 威靈仙多糖對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中醫(yī)藥通報(bào),2011,(4):61-62.

[20]郭喜軍,欒英輝,王芩.胃痞顆粒對胃癌癌前病變患者胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡及Bcl-2 P53 Fas蛋白表達(dá)的影響[J].中國藥物與臨床, 2006,(10):742-744.

[21]吳瓊,王炎,周利紅,劉寧寧,孫玨.健脾解毒方誘導(dǎo)裸鼠人胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2011,(4):701-705.

[22]沈海山,劉利維,韓瑞發(fā).去甲斑蝥素抑制人膀胱腫瘤T24 細(xì)胞增殖的作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2008,(5):456-459.

[23]Wei-HsunWang,et al.Curcumin-Induced Apoptosis in Human Hepatocellular Carcinoma J5 Cells: Critical Role of Ca2+-Dependent Pathway[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2012,(12):512907.

[24]吳勉華，李棟.消癌解毒方加入脂多糖及CD284對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的TLRs/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TLR4等mRNA和蛋白表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2012,(12):3047-3051.