寧波市2004-2013年麻疹野病毒分離株的RT-PCR檢測與分析

顧文珍，傅 燕，張 姝，胡逢蛟，潘興強(qiáng)，許國章

麻疹是一種危害嚴(yán)重、傳染性極強(qiáng)的急性呼吸道傳染病，又是一種疫苗可預(yù)防傳染病。但寧波每年都有病例，為探究寧波2004-2013年分離的麻疹病毒的來源，特對分離的31株麻疹病毒進(jìn)行基因測序和分析。

1 材料與方法

1.1病毒來源 2004-2013年在寧波市傳染病醫(yī)院就診病人，采集出疹3 d內(nèi)的疑似麻疹病人的含漱液標(biāo)本102份，離心取上清，加入終濃度含1 000 U/mL的青霉素和鏈霉素、50 U/mL的兩性霉素，4 ℃作用2 h后接種在75%淋巴信號激活因子轉(zhuǎn)染的非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero/SLAM)上，37 ℃吸附1 h后棄上清，換含2%胎牛血清的細(xì)胞維持液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，每天觀察致細(xì)胞病變(cytopathiceffect，CPE)，當(dāng)CPE≥75%時收獲凍存，如果沒有病變，反復(fù)凍融3次，再盲傳兩代，收集細(xì)胞。

1.2核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)的提取，按照德國QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit(74104)按試劑盒說明書提取麻疹病毒RNA。

1.3引物 研究所用麻疹病毒N基因片段擴(kuò)增引物根據(jù)文獻(xiàn)[1]設(shè)計，序列如下：MN-R，5′-GCCATGGGAGTAGGAGTGGAAC-3′(1113～1134)；MN-F，5 ′-CTGGCGGCTGTGTGGAC C T G - 3 ′(1737～1754)。擴(kuò)增片段大小為660 bp。

1.4系列擴(kuò)增和分析逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase-Chain Reaction,RT-PCR)采用日本TaKaRa one-step RNA PCR kit(AMV)試劑。取5 μL麻疹病毒的RNA提取物作為模板，反應(yīng)條件如下：50 ℃ 30 min逆轉(zhuǎn)錄，94 ℃ 4 min變性后，PCR循環(huán)如下：94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35周，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。核苷酸序列測定及分析擴(kuò)增后產(chǎn)物送上海英駿公司進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果的序列處理分析使用了DNAMAN軟件，其余參比的代表株序列均來自基因(GenBank)。

2 結(jié) 果

2.1病毒分離結(jié)果 102份含漱液標(biāo)本有31份發(fā)生細(xì)胞融合病變，經(jīng)過熒光PCR方法檢測證實(shí)為麻疹病毒，麻疹病毒分離成功率為30.4%，其中2004年3株、2005年5株、2007年3株、2008年10株、2012年2株、2013年8株。

2.2RT-PCR結(jié)果 所有31株病毒經(jīng)RT-PCR均擴(kuò)增出N基因碳末端的660 bp的特異性條帶。

2.3N基因末端450個核苷酸系列分析和同源性比較 31株麻疹病毒N基因碳末端450 bp核苷酸序列與GenBank中麻疹病毒各基因型參考株比較發(fā)現(xiàn)：2004-2013年寧波分離的31株麻疹病毒基因型均為H1型，其中6株為H1b基因亞型，包括2004年的1株 (NB2004-03)和2005年的所有毒株，其余的25株均為H1a亞型。31株麻疹病毒與H1a亞型參考株china93-4的同源性為97.1%～100%；與H1b亞型參考株china94-7的同源性為96.7%～100%；與中國疫苗株S191的同源性為81.9%～92.4%。與GenBank中錄入的江浙滬地區(qū)分離株核苷酸同源性較高，與上海分離株同源性為97.8%～99.6%；與江蘇省分離株同源性為98.0%～99.3%；與浙江省周邊縣市區(qū)分離株同源性為98.0%～99.3%。

2.4分離株與疫苗株氨基酸系列比對 31株N基因末端450 個核苷酸翻譯的氨基酸與中國疫苗株S191的同源性為87.2%～90.6%，在14個位點(diǎn)31株分離株的氨基酸系列完全相同，但與疫苗株S191不同，具體差異見表1。

表1寧波麻疹病毒分離株與疫苗株S191N基因羧基末端450個核苷酸翻譯的氨基酸系列比對分析

Tab.1Deducedaminoacidsequencesofthe450C-terminusnucleotidesequencesoftheNgenebetweenstrainsisolatedfromNingboandS191

位點(diǎn)Site404405430446449450469474478480504515517521疫苗株S191KIRASYGTPSSTHN寧波分離株Strains isolated from NingboRTGTNSSISYLRYD

3 討 論

自從1963年麻疹減毒活疫苗的廣泛使用，麻疹的發(fā)病率和死亡率急劇下降，但在疫苗可以預(yù)防疾病中依然是引起兒童死亡的第1位原因，在2008年，麻疹病毒世界范圍引起164 000名兒童死亡[2-3]。麻疹病毒的基因型別具有地理分布特征，不同地區(qū)有不同的本土流行株或優(yōu)勢流行株。監(jiān)測麻疹病毒的基因特征對分析病毒的起源、基因變異和傳播途徑，辨別疫苗株和野毒株以及制定鞏固消除麻疹成果具有重要意義。

寧波市2004-2013年共分離到31株麻疹病毒，主要集中在2004年、2005年、2007年、2008年、2012年和2013年這6年，這一現(xiàn)象正好與這幾年寧波的流行高峰相關(guān)。僅2004年和2005年流行株為H1b亞型，其余25株均為H1a亞型，H1a亞型毒株與2009-2011年間江浙滬地區(qū)分離的野毒株在系統(tǒng)進(jìn)化樹的分支上比較接近，其核苷酸同源性比較高，與國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)對麻疹毒株基因流行的優(yōu)勢毒株研究的也報道一致[4-6]。31株毒株中，每一年的優(yōu)勢株形成一個小的分支，核苷酸之間的差異為零或者很小。不同年份也有基因系列完全相同的毒株在流行，表明存在同一毒株的持續(xù)循環(huán)現(xiàn)象；還有同一年份分離的毒株處在不同分支，表明病毒在自然選擇及免疫壓力下存在一定變異，導(dǎo)致出現(xiàn)較多分支，呈現(xiàn)不同的病毒傳播鏈[7]。

徐聞青與嚴(yán)菊英等報道麻疹免疫者產(chǎn)生的中和抗體水平低于自然感染者，疫苗產(chǎn)生的抗體中和野病毒株的能力低于中和疫苗株，這些均說明現(xiàn)用的MV 對當(dāng)今麻疹病毒流行株的保護(hù)作用已下降，但這種保護(hù)作用的下降可能僅處于量變過程，并已影響到MV 的免疫持久性[8-10]。寧波31株分離株與中國疫苗株S191的核苷酸在基因水平上存在較大差異，同源性較低，為91.1%～92.4%，翻譯的氨基酸的差異性高達(dá)9.4%～12.8%，據(jù)文獻(xiàn)報道，N蛋白上有3個抗原決定簇NP1、NP2、NP3，分別位于122～150、457～476、519～525位氨基酸[12]。寧波31株分離株與疫苗株14個不同的氨基酸系列位點(diǎn)，10個位點(diǎn)位于抗原決定簇或附近，這些氨基酸位點(diǎn)的變異均可能導(dǎo)致一定程度的抗原性改變，也從分子水平間接證明現(xiàn)行MV的血清學(xué)保護(hù)性降低的量變結(jié)果，基因和蛋白水平的變化為現(xiàn)用疫苗的持續(xù)監(jiān)測和新疫苗的開發(fā)提供了有力的參照。

隨著麻疹野毒株N基因的變異，由麻疹疫苗誘導(dǎo)的免疫是否能保護(hù)野病毒株的攻擊，以及保護(hù)年限的多少將是一個重要的研究課題。因此，我們以后要從分子生物學(xué)和免疫學(xué)上加大對寧波流行的麻疹野毒株的監(jiān)測，為寧波更好的消滅麻疹和鞏固成效提高理論依據(jù)。

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