禽流感病毒特異性NP單克隆抗體的鑒定及禽流感特異性檢測方法的建立

桂 勛，張旭輝，柯少君，李 睿，黃 彬，沈晨光，郭小怡，康雅虹，陳俊煜，王明睿，陳毅歆,，夏寧邵,

流感病毒屬于正粘病毒科，單鏈負義的RNA病毒，根據(jù)其核蛋白(NP)及基質蛋白(M)抗原性的不同，分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型；根據(jù)其表面膜蛋白血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的抗原性不同，分為16種H亞型和10種N亞型[1]。甲型流感病毒宿主廣泛，能夠感染禽、人、豬、馬等動物，其中感染人類的主要有禽流感病毒和人流感病毒。人類甲型流感病毒主要有H1N1、H3N2和H2N2等3種，曾多次引起全球流感大流行[2-4]。禽流感病毒在自然界中廣泛存在，目前已從禽類中分離到16種H亞型和10種N亞型的禽流感病毒[5]。禽流感病毒一般不能感染人類，但自1997年香港發(fā)生人感染禽流感H5N1病毒致死事件后，自然界中不斷發(fā)生禽流感病毒突破種屬屏障感染人類的事件，如禽流感病毒H5N1、H9N2、H7N7、H7N9、H10N8等[6-10]，給人類健康和社會經濟造成嚴重危害。更令人擔憂的是，禽流感病毒與人流感病毒一旦發(fā)生基因重排，很容易形成能在人群中穩(wěn)定傳播的高致病性流感病毒株，造成全球流感大流行。因此，建立一種特異識別禽流感病毒的檢測工具，有助于及時發(fā)現(xiàn)禽流感病毒，對禽流感病毒進行源頭控制，防止禽流感疫情的擴散傳播，防止發(fā)生禽流感病毒與人流感病毒的交叉感染事件，對降低禽流感的危害具有現(xiàn)實意義。目前國內外已有許多甲型流感病毒的抗原快速檢測試劑得到應用[11]，這些試劑多是特異識別甲型流感病毒NP蛋白，一般不能區(qū)分鑒別人流感病毒和禽流感病毒。鑒于禽流感病毒NP與人流感病毒NP存在抗原性差異，本研究擬通過篩選能夠鑒別區(qū)分人流感NP和禽流感NP的單抗，進而建立一種能特異檢測禽流感病毒但不識別人流感病毒的檢測方法，為禽流感病毒的特異性診斷提供一種可行的檢測工具。

1 材料與方法

1.1細胞、病毒與實驗動物 小鼠骨髓瘤細胞株Sp2/0-Ag14(Sp2/0)以及MDCK細胞均為本中心保存。部分流感病毒株由香港大學微生物系陳鴻霖博士惠贈，部分流感病毒為本中心分離獲得。BALB/c小鼠(6 ～ 8周齡)購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2主要試劑及耗材 PEG1350、次黃嘌呤、胸腺嘧啶、氨基喋呤、DMSO、HRP、顯色底物、FITC標記羊抗鼠二抗及DAPI均為Sigma公司產品。RPMI1640以及DMEM基礎培養(yǎng)基為Gibco公司產品。胎牛血清為Hyclone公司產品。檢測標HRP的兔多抗所用到的羊抗兔IgG由北京萬泰生物藥業(yè)有限公司提供。各種常規(guī)化學試劑為國產分析純。硝酸纖維素膜為MDI公司的產品。滲濾裝置由本中心完全自主設計開發(fā)[12]。

1.3NP基因進化樹的制作 NP基因進化樹采用軟件MEGA5.0制作。

1.4NP重組蛋白的表達 首先，從NP進化樹上選取禽源病毒分支上的代表株A/HK/212/03(H5N1，HK/212)及人源病毒分支上的代表株A/California/04/2009(H1N1，CA/04)，利用RT-PCR的方法從病毒中調取NP基因全長序列，并進行測序鑒定。然后，采用常規(guī)分子克隆的方法分別構建克隆pET-28a/NP-HK/212及pET-28a/NP-CA/04，在E.coli菌株BL21中進行大量表達，取上清進行Ni2+柱親和層析純化，純化后的NP重組蛋白的純度采用10% SDS-PAGE做鑒定。

1.5NP單抗的制備 以50 μg rNP-HK/212稀釋至250 μL，再與等量的福氏完全佐劑混勻，經皮下注射免疫BALB/c小鼠，劑量為500 μL/次。初免后第15 d和29 d，分別用同樣劑量的重組蛋白加福氏不完全佐劑進行加強免疫。在融合前3 d，再以20 μg重組蛋白經脾臟注射做最后的加強免疫。細胞融合、細胞克隆化、腹水誘導及純化均按常規(guī)方法進行，融合雜交瘤細胞株的篩選使用基于rNP-HK/212的ELISA進行檢測。

1.6NP單抗的免疫熒光檢測 利用4%的多聚甲醛固定禽流感病毒A/Teal/Hong Kong/W312/97(H6N1)和人流感病毒A/California/04/2009 (H1N1)感染的MDCK細胞，經0.03% TritonX-100通透后，加入山羊血清進行封閉1 h。加入相應的檢測抗體反應1 h，PBS洗滌3次，再加入羊抗鼠二抗GAM-FITC反應40 min。經PBS洗滌3次后，加入DAPI染核5 min，用PBS洗滌5次后進行封片鏡檢。

1.7Dot-ELISA 首先將高純度的NP單抗(如1F2及19C10)按5 μg/孔包被于硝酸纖維素膜的樣品檢測區(qū)，同時包被200 ng的羊抗兔IgG于對照區(qū)，25 ℃干燥后真空封裝4 ℃保存?zhèn)溆?。檢測步驟為：①樣品處理：200 μL樣品與400 μL裂解液充分混勻；②加樣：將上述處理后的樣品全部加入樣品檢測區(qū)，待樣品完全滲入后，摘掉流控裝置；③加入酶標二抗：滴加200 μL酶標抗體(HRP標記的兔抗NP蛋白多克隆抗體)，待樣品完全滲入后，靜置2 min；④洗滌：用洗滌液洗滌2次；⑤顯色：待洗液滲入后，加入100 μL顯色液，顯色3 min；⑥終止讀值：加入100 μL終止液，在5 min以內判定結果。

2 結 果

2.1甲型流感病毒NP基因的進化分析 首先，利用軟件MEGA5.0對從GenBank上選取的不同分離時間、不同分離地點的甲型流感病毒NP基因進行了進化分析。結果顯示，禽流感病毒與人流感病毒處在兩個完全不同的分支上，禽流感病毒用紅色標注，人流感病毒用藍色標注(圖1)，說明禽流感NP和人流感病毒NP的抗原性可能存在不同。在此基礎上，分別選取了禽流感病毒分支上的代表株A/HK/212/03 (H5N1)(黑點標注)及人流感病毒分支上的代表株A/California/04/2009 (H1N1)(紅點標注)用于后續(xù)NP重組蛋白的表達、單抗制備及鑒定。

2.2NP重組蛋白的表達及純化 采用RT-PCR的方法從A/HK/212/03及A/California/04/2009中調取了NP基因，經測序鑒定正確后，分別構建了pET-28a/NP-HK/212及pET-28a/NP-CA/04兩種重組表達質粒。在E.coli菌株BL21(DE3)中進行大量表達后，利用親和層析的方法純化制備出高純度的禽流感病毒NP抗原rNP-HK/212和人流感病毒NP抗原rNP-CA/04(圖2)。

2.3NP單克隆抗體的制備 利用獲得的rNP-HK/212重組蛋白免疫BALB/c小鼠，在免疫3針后選取血清滴度最高的兩只小鼠進行了細胞融合實驗及單抗篩選，共制備出抗rNP-HK/212單抗53株，并利用Protein A親和層析的方式獲得了高純度的單抗。

2.4禽流感病毒NP蛋白特異性單抗的鑒定 利用間接ELISA的方法分別檢測了上述53株單抗對rNP-HK/212及rNP-CA/04兩種重組NP蛋白的反應性。根據(jù)單抗與兩類NP抗原的反應性不同，可以將上述53株單抗分成三類(Class Ⅰ，Class Ⅱ和Class Ⅲ)，其中Class Ⅰ類單抗有45株，該類單抗對兩種NP重組蛋白均有很好的反應性；Class Ⅱ類單抗有3株，該類單抗對禽流感病毒NP重組蛋白rNP-HK/212有很好的反應性，但對人流感病毒NP重組蛋白rNP-CA/04不反應；Class Ⅲ類單抗對人流感病毒NP重組蛋白rNP-CA/04有很好的反應性，對禽流感病毒NP重組蛋白rNP-HK/212的反應性明顯減弱(圖3)。分別選取Class Ⅰ類單抗代表株19C10及Class Ⅱ 類單抗代表株1F2作為包被抗體檢測其對禽流感病毒及人流感病毒的免疫熒光活性。結果顯示，Class Ⅰ類單抗19C10對禽流感病毒A/Teal/Hong Kong/W312/97 (H6N1)及人流感病毒A/California/04/2009 (H1N1)均有很好的反應性；Class Ⅱ類單抗1F2對禽流感病毒有很好的反應性，但對人流感病毒不反應(圖4)。說明Class Ⅱ類單抗能夠特異識別禽流感病毒NP蛋白。

圖1甲型流感病毒NP基因的進化分析

Fig.1PhylogenetictreebuiltwithNPsequencesofinfluenzaAvirus

圖2NP重組蛋白的制備

Fig.2PreparationofrecombinantNPantigensrNP-HK/212andrNP-CA/04

圖3 NP單抗的分類鑒定結果

圖4 兩類NP單抗的免疫熒光檢測結果

2.5禽流感病毒特異性Dot-ELISA檢測方法的建立 本中心已研制出了多種酶聯(lián)免疫滲濾(Dot-ELISA)檢測試劑[12-13]。本研究在成熟的Dot-ELISA技術基礎上，以禽流感病毒NP蛋白特異性單抗1F2作為包被抗體，以辣根過氧化物酶標記的NP兔多抗作為標記抗體，建立一種特異檢測禽流感病毒的檢測試劑AIV-Dot-ELISA。為評估該方法的檢測效果，用19個不同亞型的禽流感病毒、8個不同亞型的人流感病毒和2個乙型流感病毒進行評估(表1)，發(fā)現(xiàn)以Class Ⅱ 類單抗1F2為包被單抗的檢測方法對19個禽流感病毒全部能夠檢出，其檢測分析靈敏度約為0.025 ～ 0.1 HA titer，其對病毒濃度為5 HA titer 的8個人流感病毒和2個乙型流感病毒的檢測均為陰性。而采用Class Ⅰ類NP廣譜單抗19C10作為包被抗體的對照試劑對所有的甲型流感病毒均能檢出，不能鑒別區(qū)分禽源流感病毒和人源流感病毒。上述結果說明本研究建立的禽流感特異性檢測方法是有效可行的，下一步還需評估其對禽類拭子標本和人類拭子標本的檢測效果。

3 討 論

本研究利用分子進化分析選擇了一個禽流感病毒NP基因和一個人流感病毒NP基因進行原核表達，獲得兩個高純度的重組NP抗原，進而應用于NP單抗的篩選，獲得3類NP特異性單抗，其中以1F2為代表的NP單抗只特異識別禽流感病毒而不識別人流感病毒，為構建特異識別禽流感病毒的檢測方法奠定了基礎。在此基礎上，基于Dot-ELISA抗原快速檢測技術平臺，用禽流感病毒NP特異性單抗1F2作為包被抗體，成功建立起一個只特異識別禽流感病毒而不識別人流感病毒的適于禽類流感檢測的抗原快速檢測方法AIV-Dot-ELISA。鑒于近年來不同類型的禽流感病毒(H5N1、H9N2、H7N7、H7N9和H10N8)頻頻感染人類[6-8]，而當前的甲型流感病毒快速檢測試劑不能夠鑒別區(qū)分禽流感病毒和人流感病毒的感染，因此，本研究建立的方法將有助于快速鑒別禽流感病毒的存在，將為禽流感疫情控制和人感染禽流感病毒鑒別診斷提供一種可行的分析檢測工具。

表1 AIV-Dot-ELISA檢測試劑對禽流感病毒及人流感病毒的檢測結果

Note: +,Positive; -,Negative;

本研究獲得的NP單抗可分成3類，Class Ⅰ類NP廣譜單抗，對禽流感病毒和人流感病毒的識別能力相當；Class Ⅲ類NP單抗，只識別禽流感病毒而不識別人流感病毒；Class Ⅱ類單抗，對人流感病毒的識別活性顯著高于對禽流感病毒的識別活性。這3類單抗存在的不同反應性特征說明流感病毒NP的抗原性存在宿主特異性，不同宿主來源的NP基因可能因為序列不同，存在不同的抗原性表位，這樣的獨特性表位可以被特異性單抗所鑒別區(qū)分，從而可被用來建立宿主特異性檢測方法。下一步工作除了進一步利用臨床采集標本完善評估該方法的檢測效果外，還有必要利用表位分析方法研究上述3類單抗識別表位的特征區(qū)別，從而發(fā)現(xiàn)流感病毒中與宿主特異性相關的關鍵表位氨基酸及其在流感病毒生物學中的潛在功能。另外，本研究將為建立其他種屬特異性流感病毒檢測方法或亞型特異性流感病毒檢測方法提供一種可供借鑒的研究經驗。

參考文獻：

[1]Peiris JS,de Jong MD,Guan Y. Avian influenza virus (H5N1): a threat to human health[J]. Clin Microbiol Rev,2007,20(2): 243-267. DOI: 10.1128/CMR.00037-06

[2]Patterson KD,Pyle GF. The geography and mortality of the 1918 influenza pandemic[J]. Bull Hist Med,1991,65(1): 4-21. DOI: 10.1353/bhm.2002.0022.

[3]Fraser C,Donnelly CA,Cauchemez S,et al. Pandemic potential of a strain of influenza A (H1N1): early findings[J]. Science,2009,324(5934): 1557-1561. DOI: 10.1126/science.1176062

[4]Muscatello DJ,Cretikos MA,Macintyre CR. All-cause mortality during first wave of pandemic (H1N1) 2009,New South Wales,Australia,2009[J]. Emerg Infect Dis,2010,16(9): 1396-1402. DOI: 10.3201/eid1609.091723

[5]Alexander DJ. A review of avian influenza in different bird species[J]. Vet Microbiol,2000,74(1-2): 3-13. DOI: 10.1016/S0378-1135(00)00160-7

[6]Li KS,Guan Y,Wang J,et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia[J]. Nature,2004,430(6996): 209-213. DOI: 10.1038/nature02746

[7]Gao R,Cao B,Hu Y,et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus[J]. N Engl J Med,2013,368(20): 1888-1897. DOI: 10.1056/NEJMoa1304459

[8]Butt KM,Smith GJ,Chen H,et al. Human infection with an avian H9N2 influenza A virus in Hong Kong in 2003[J]. J Clin Microbiol,2005,43(11): 5760-5767. DOI: 10.1128/JCM.43.11.5760-5767.2005

[9]Du Ry van Beest Holle M,Meijer A,Koopmans M,et al. Human-to-human transmission of avian influenza A/H7N7,The Netherlands,2003[J]. Euro Surveill,2005,10(12): 264-268.

[10]Parry J. H10N8 avian flu virus claims its first known human casualty[J]. BMJ,2014,348: g1360. DOI: 10.1136/bmj.g1360

[11]Reina J,Padilla E,Alonso F,et al. Evaluation of a new dot blot enzyme immunoassay (directigen flu A+B) for simultaneous and differential detection of influenza a and B virus antigens from respiratory samples[J]. J Clin Microbiol,2002,40(9): 3515-35157. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3515-3517.2002

[12]Chen Y,Xu F,Fan X,et al. Evaluation of a rapid test for detection of H5N1 avian influenza virus[J]. J Virol Methods,2008,154(1-2): 213-215. DOI: 10.1016/j.jviromet.2008.08.013

[13]Chen Y,Xu F,Gui X,et al. A rapid test for the detection of influenza A virus including pandemic influenza A/H1N1 2009[J]. J Virol Methods,2010,167(1): 100-102. DOI: 10.1016/j.jviromet.2010.02.001