熱休克蛋白90與不良妊娠結(jié)局的相關(guān)性研究

于湄 張雪玲 孟艷岑 范玉香

近年來，不良妊娠的發(fā)生率越來越高，對(duì)于不良妊娠的影響因素眾說紛紜，包括妊娠期高血壓、肥胖、過度緊張、年齡較高等，而對(duì)于其發(fā)生機(jī)制尚無定論。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是所有生物細(xì)胞在應(yīng)激原刺激后，發(fā)生熱休克反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的一類細(xì)胞伴侶蛋白的總稱。研究證實(shí)，HSP對(duì)于腫瘤細(xì)胞的分化及凋亡的調(diào)控有重要作用。本課題以不良妊娠患者為研究對(duì)象，觀察比較正常妊娠組及不良妊娠組孕婦外周血及胎盤組織中HSP90的表達(dá)情況，為探討熱休克蛋白90與不良妊娠發(fā)生的關(guān)系，試圖探索不良妊娠期發(fā)病機(jī)制，以便為更好的防治本病，降低不良妊娠奠定理論基礎(chǔ)

1 資料與方法

1.1 一般資料2009年10月至2010年10月在我院住院分娩的孕婦共170例，年齡22～34歲，平均年齡28.85歲，所有病例均為單胎初次分娩，無基礎(chǔ)疾病:(1)正常妊娠組:共70例，體重60～90 kg，平均73 kg，足月順產(chǎn)，未出現(xiàn)不良母嬰并發(fā)癥;(2)不良妊娠組:共100例，體重62～89 kg，平均73 kg，出現(xiàn)妊娠期高血壓疾病、甲功異常、早產(chǎn)、胎膜早破、胎兒生長(zhǎng)受限等母嬰不良妊娠結(jié)局。2組一般資料有均衡性。

1.2 方法

1.2.1 外周血及胎盤組織標(biāo)本采集:所有研究對(duì)象晨起空腹采肘靜脈血2 ml。將采集到的血液標(biāo)本置入不含抗凝劑的試管中，混勻，待血液完全凝集后4℃條件下3 000 r/min離心10 min，取上清液置于另一個(gè)無菌不含抗凝劑的試管中，-80℃保存待測(cè)。在胎盤娩出后，立即切取指腹大小的胎盤組織，包于無菌錫箔紙中，-80℃保存待測(cè)。

1.2.2 ELISA檢測(cè)外周血血清中HSP90的含量:在酶標(biāo)檢測(cè)儀上，以空白對(duì)照孔調(diào)零后，在450 nm處分別讀出各孔的OD值，經(jīng)酶標(biāo)儀內(nèi)置分析軟件，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)品曲線。根據(jù)各孔待檢測(cè)樣品(血清)的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相應(yīng)的濃度。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè)胎盤組織中HSP90 mRNA的含量:Real-time PCR試劑購自大連TAKARA生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。根據(jù)Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列。HSP90引物序列為:上游引物(5’-3’):GATAAGGCAGTTAAGGACC，下游引物(5’-3’):ATAGATGCGGTTGGAGTG;以 βactin作為內(nèi)參，上游引物(5’-3’):GAGACCTTCAACACCCCAG，下 游 引 物(5’-3’):GCCATCTCTTGCTCGAAGTC;引物交由大連TAKARA生物科技有限公司合成。采用二步法進(jìn)行熒光定量PCR，先進(jìn)行95℃，30 s的熱啟動(dòng)，再進(jìn)行95℃，5 s的預(yù)變性，然后進(jìn)行60℃，20 s 40個(gè)循環(huán)PCR反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束收集熒光，根據(jù)熒光強(qiáng)度繪制擴(kuò)增曲線。95℃30 s，55℃30℃，95℃30 s，5～95℃每隔0.3度收集熒光，根據(jù)熒光強(qiáng)度經(jīng)換算生成熔解曲線，進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 外周血血清中HSP90的含量 正常妊娠組與不良妊娠組外周血中HSP90水平分別為(0.6±0.4)ng/ml，(1.6±0.4)ng/ml。2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 胎盤組織中HSP90mRNA的含量 正常妊娠組與不良妊娠組胎盤組織中HSP90含量分別為(1.15±0.03)，(3.89±0.78)。與正常妊娠組相比，不良妊娠組胎盤組織中HSP90水平明顯高于正常妊娠組(P＜0.05)。

3 討論

HSP是所有生物細(xì)胞在應(yīng)激原刺激后，發(fā)生熱休克反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的一類細(xì)胞伴侶蛋白的總稱。HSP90是熱休克蛋白家族中的重要成員之一，是存在于真核生物和細(xì)菌中的一種基本的重要分子伴侶，是細(xì)胞內(nèi)最活躍的分子伴侶蛋白之一，作為特異分子伴侶的HSP90參與多種信號(hào)途徑中的激酶和核受體家族、P53等轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、分化、蛋白質(zhì)合成、折疊運(yùn)輸和分解、細(xì)胞骨架的功能、膜功能以及應(yīng)激條件下對(duì)細(xì)胞的保護(hù)等生理代謝中起著重要的生物學(xué)作用。HSP90通過與100多種底物蛋白質(zhì)相互作用，參與調(diào)控和維持多種蛋白的構(gòu)象和作用，對(duì)細(xì)胞內(nèi)許多生物過程如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡都有重要作用［1］。機(jī)體遭受組織損傷、病原微生物感染、炎性細(xì)胞因子等均可引起HSP的過量表達(dá)，以維持細(xì)胞的正常功能。

有研究提示，HSP90在妊娠期高血壓組、輕度子癇前期組、重度子癇前期組胎盤中的蛋白和基因表達(dá)明顯強(qiáng)于正常組，且呈逐漸加強(qiáng)的趨勢(shì)［2］。不良妊娠的發(fā)生是多種因素作用，其具體機(jī)制尚不明確。HSP90參與細(xì)胞周期的調(diào)控，通過腫瘤研究發(fā)現(xiàn)HSP90活性被抑制后可以使乳腺癌細(xì)胞株停滯在G1期，而且這種阻滯的發(fā)生依賴于細(xì)胞內(nèi)Rb的表達(dá)，并最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分化或凋亡［2，3］，因此，HSP90對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控具有重要作用。本研究中，不良妊娠組胎盤組織及外周血中HSP90的表達(dá)明顯高于正常妊娠組，提示HSP90可能參與了不良妊娠的發(fā)生過程，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，HSP90高表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，它能與細(xì)胞內(nèi)的一些輔分子伴侶結(jié)合成不同的多蛋白復(fù)合體，并通過維持期“受體蛋白”，如Akt、Raf-1、HER-2/nen等的穩(wěn)定和活性間接地調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多條與細(xì)胞增殖、分化、存活以及凋亡有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，其獨(dú)特的性質(zhì)使其成為抗腫瘤治療的良好靶點(diǎn)，認(rèn)為其抑制劑為有希望的抗癌治療藥物［2-4］。HSP90能與活化蛋白激酶C受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合HIF-1α，從而使其免于非氧依賴方式的降解以維持其穩(wěn)定，并影響低氧時(shí)低氧誘導(dǎo)因子的核轉(zhuǎn)位、與HIF-1β的異二聚化及轉(zhuǎn)錄活性等，進(jìn)而抑制其細(xì)胞凋亡。HSP是一種應(yīng)激蛋白，廣泛存在于人、動(dòng)物、微生物內(nèi)。有研究表明，通過檢測(cè)血清中HSP70，可間接反映疾病與熱休克蛋白之間相互作用的關(guān)系［4］。妊娠期高血壓疾病時(shí)升高的血清HSP70不僅僅來源于胎盤組織的釋放，亦來自疾病嚴(yán)重時(shí)累及其他臟器時(shí)機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)［4］。隨HELLP程度加重，血清HSP70含量越高，因此血清HSP70含量在HELLP診斷、療效觀察及衡量疾病嚴(yán)重程度方面具有重要的臨床價(jià)值［5］。

劉彥霞等［6］研究發(fā)現(xiàn)，與正常者相比，在胎盤血管病患者中HSP70表達(dá)明顯增高，提示HSPs高表達(dá)引起了內(nèi)在免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)，參與胎盤血管病的發(fā)生機(jī)制。另外，HSP90伴侶分子的干擾可引起Pnck誘導(dǎo)的EGFR降解，從而干擾新生血管的形成［7］。Rangaraju等［8］研究發(fā)現(xiàn)，HSPs在神經(jīng)病學(xué)模型中可以誘導(dǎo)髓鞘的發(fā)生，說明HSPs可以參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育;Luo等［9］通過實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，HSP90β同樣參與了乙酰膽堿受體的構(gòu)建及穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)，不良妊娠結(jié)局如妊娠期高血壓疾病、胎兒生長(zhǎng)受限患者其血清及胎盤組織中HSP90的含量明顯高于正常妊娠，且與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，說明其在不良妊娠的發(fā)生、發(fā)展過程中有一定作用。研究表明，妊娠期高血壓疾病的發(fā)病機(jī)制是由于滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤不足減少子宮胎盤灌注，導(dǎo)致胎盤缺血缺氧，誘發(fā)生物活性因子的釋放，導(dǎo)致血管效應(yīng)而產(chǎn)生血壓升高［9］。在胎兒生長(zhǎng)受限時(shí)，子宮螺旋動(dòng)脈壁出現(xiàn)大量泡沫細(xì)胞，即急性粥樣硬化現(xiàn)象，因而導(dǎo)致子宮胎盤血流量降低，導(dǎo)致低氧狀況，出現(xiàn)胎盤功能不良，從而影響胎兒的生長(zhǎng)及發(fā)育。機(jī)體細(xì)胞受到各種應(yīng)激刺激如缺氧、缺血，感染等刺激的情況下會(huì)釋放多肽，同時(shí)攜帶具有免疫原性的多肽，產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這些因素有可能增加HSP90的表達(dá)，進(jìn)而致使循環(huán)中HSP90水平增高。HSP90參與了胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育的某些重要過程，其與不良妊娠結(jié)局的發(fā)生關(guān)有一定關(guān)系，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

1 Zhao R，Houry WA.Molecular interaction network of the Hsp90 chaperone system.Adv Exp Med Biol，2007，594:27-36.

2 Strethapakdi M，Liu F，Tavorath R，et al.Inhibition of Hsp90 function by ansamycins causes retinoblastoma gene product-dependent G1 arrest.Cancer Res，2000，60:3940-3946.

3 Munster PN，Srethapakdi M，Moasser MM，et al.Inhibition of heat shock protein 90 function ansamycins causes the morphological and functional differentiation of breast cancer cells.Cancer Res，2001，61:2945-2952.

4 趙勇，耿素敏，張瑞清，等.妊高癥患者血清熱休克蛋白70水平的表達(dá)及意義.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19:135-136.

5 耿素敏，趙勇，嚴(yán)真真.血清熱休克蛋白70在重度子癇前期合并HELLP綜合征中的價(jià)值探討.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2009，11:2100-2101.

6 劉彥霞，徐健，王欣.熱休克蛋白70與胎盤血管病中內(nèi)皮激活的相關(guān)研究.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2010，26:222-226.

7 Deb TB，Zuo AH，Wang Y，et al.Pnck induces ligand-independent EGFR degradation by probable perturbation of the Hsp90 chaperone complex.Am J Physiol Cell Physiol，2011，300:C1139-1154.

8 Rangaraju S，Madorsky I，Pileggi JG，et al.Pharmacological induction of the heat shock response improves myelination in a neuropathic model.Neurobiol Dis，2008，32:105-115.

9 Luo S，Zhang B，Dong XP，et al.HSP90 beta regulates rapsyn turnover and subsequent AChR cluster formation and maintenance.Neuron，2008，60:97-110.