胡 萍,魏琳琳,王新華,余大為,許小紅,翟育忠,劉愛芳
(1.甘肅省疾病預(yù)防控制中心,甘肅 蘭州 730020;2.甘肅省慶陽市疾病預(yù)防控制中心,甘肅 慶陽745000)
配方奶粉中克雷伯菌選擇性培養(yǎng)方法的研究
胡 萍1,魏琳琳1,王新華1,余大為1,許小紅1,翟育忠1,劉愛芳2
(1.甘肅省疾病預(yù)防控制中心,甘肅 蘭州 730020;2.甘肅省慶陽市疾病預(yù)防控制中心,甘肅 慶陽745000)
目的 為提高配方奶粉中克雷伯菌的分離鑒定效率,研制專門用于克雷伯菌分離培養(yǎng)的選擇性培養(yǎng)基。方法 依據(jù)克雷伯菌生化特性,研制成改良麥康凱(MACI)培養(yǎng)基,觀察克雷伯菌及其他乳糖陽性的腸桿菌科細(xì)菌菌落在MACI平板、SS平板、麥康凱(MAC)平板和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBGA)平板上的生長特點;用產(chǎn)酸克雷伯菌(ATCC13182)和肺炎克雷伯菌(ATCC10031)檢測MACI培養(yǎng)基的生長率和最低檢出限。結(jié)果 克雷伯菌在MACI平板上形成獨特的紅色菌落,而其他腸桿菌為無色菌落;肺炎克雷伯菌(ATCC10031)和產(chǎn)酸克雷伯菌(ATCC13182)在MACI培養(yǎng)基上的生長率分別為0.936 6和0.898 8;最低檢出限均為40 cfu/g。結(jié)論 MACI可作為分離克雷伯菌的理想選擇性培養(yǎng)基。
配方奶粉;克雷伯菌;選擇性培養(yǎng)方法
克雷伯菌屬腸桿菌科,營養(yǎng)要求不高。其中的肺炎克雷伯菌及產(chǎn)酸克雷伯菌是重要的條件致病菌和醫(yī)源性感染菌,且對抗生素易產(chǎn)生耐藥性[1~5]。免疫力低下的個體感染此類菌后,可存在罹患肺炎、腸炎、腦膜炎、敗血癥和食物中毒等風(fēng)險[2,6~14]。FAO/WHO于2004年5月在日內(nèi)瓦召開的“嬰兒配方奶粉中阪崎桿菌和其他微生物”的聯(lián)席會議上,將克雷伯菌列為嬰兒配方奶粉中B類致病菌[15,16],并要求成員國實施有效的監(jiān)控。
克雷伯菌分解乳糖,在以往的腸道選擇性培養(yǎng)基上,不易與其他乳糖陽性的腸桿菌科的細(xì)菌區(qū)分。本項目組嘗試?yán)每死撞煞纸鈧?cè)金盞花醇的生化特點[17],對傳統(tǒng)腸道菌選擇性培養(yǎng)基麥康凱(MAC)加以改良,研制出提高克雷伯菌分離培養(yǎng)效率的改良麥康凱(MACI)培養(yǎng)基,并對市場銷售配方奶粉中克雷伯菌進(jìn)行分離鑒別,比較4種腸道選擇性培養(yǎng)基的分離效率,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。
1.1 材料
1.1.1 試劑 營養(yǎng)瓊脂(NA)、營養(yǎng)肉湯(NB)、緩沖蛋白胨水(BPW)、SS瓊脂、麥康凱(MAC)瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBGA)、3號膽鹽(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);中性紅(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);生理鹽水(甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司);瓊脂粉、蛋白胨(日本進(jìn)口分裝);側(cè)金盞花醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);VITEK 2 GN-菌種鑒定卡(美國bioMerieux.Ine公司)。以上試劑均在有效期內(nèi)。
1.1.2 儀器 VITEK 2全自動生化鑒定儀(bioMerieux)、恒溫培養(yǎng)箱、麥?zhǔn)蠞岫缺葷醿x(法國梅里埃公司)。
1.1.3 試驗菌株 產(chǎn)酸克雷伯菌(ATCC13182)、肺炎克雷伯菌(ATCC10031)、產(chǎn)氣腸桿菌(NCIMB10102)、陰溝腸桿菌(ATCC23355)、費勞地枸櫞酸桿菌(ATCC8090)標(biāo)準(zhǔn)菌株(上海漢尼生物技術(shù)有限公司);大腸埃希菌(ATCC25922)標(biāo)準(zhǔn)菌株、產(chǎn)酸克雷伯菌(8株)和肺炎克雷伯菌(12株)臨床分離菌株由甘肅省人民醫(yī)院檢驗中心饋贈。
1.2 MACI培養(yǎng)基的研制
1.2.1 參照MAC培養(yǎng)基的制備方法[18]將其中的乳糖成分用側(cè)金盞花醇替代,配制方法如下:蛋白胨20 g,氯化鈉5 g,瓊脂20~25 g,膽鹽5 g,蒸餾水1 000 ml,將各成分加入蒸餾水中,加熱溶解,調(diào)節(jié)pH至7.4,加入1%中性紅水溶液5 ml,分裝適當(dāng)容器,115℃高壓滅菌15 min,溫度降至60℃左右,加入側(cè)金盞花醇10 g,充分混勻,制成平板備用。
1.2.2 選擇性培養(yǎng)基的分離培養(yǎng) 實驗室引進(jìn)的菌株均經(jīng)VITEK 2進(jìn)行鑒定。菌株復(fù)活后,分別接種腸道菌選擇性培養(yǎng)基SS、MAC、VRBGA和MACI平板,培養(yǎng)后觀察菌株在各種平板上的菌落形態(tài)。
1.2.3 MACI培養(yǎng)基的質(zhì)控[19](1)克雷伯菌在MACI培養(yǎng)基上生長率的測定。產(chǎn)酸克雷伯菌(ATCC13182)和肺炎克雷伯菌(ATCC10031)經(jīng)NB培養(yǎng)后,菌液濃度達(dá)到108個/ml。用生理鹽水對菌液依次做10倍遞增稀釋,稀釋濃度至100個/ml。各取1 ml菌液,涂布法分別接種于NA平板和MACI平板,檢測克雷伯菌在MACI培養(yǎng)基上的生長率(生長率=待測培養(yǎng)基菌落計數(shù)/對照培養(yǎng)基菌落計數(shù)),結(jié)果見表1。
表1 克雷伯菌在不同濃度培養(yǎng)基上的生長試驗
(2)克雷伯菌在MACI培養(yǎng)基上最低檢出限的測定。無菌取8份配方奶粉(已知無腸桿科細(xì)菌),每份25 g,分別加到225 ml NB中,均質(zhì)。取濃度為100~107個/ml的菌液各1 ml,分別加到8份配方奶粉中,混勻,然后各取1 ml,涂布法接種于MACI平板,結(jié)果見表2。
表2 不同濃度克雷伯菌在MACI瓊脂上的生長計數(shù)情況
1.3 市場銷售配方奶粉中克雷伯菌的檢測及MACI培養(yǎng)基應(yīng)用效果的評判
1.3.1 樣品 市場銷售的1階段(0~6月)、2階段(6~12月)、3階段(1~3歲)和4階段(3歲以上)18個品牌的配方奶粉,共計98份。
1.3.2 配方奶粉中克雷伯菌的檢測步驟 無菌稱取配方奶粉100 g置于900 ml BPW中混勻培養(yǎng)后,從中取25 ml置于225 ml NB中混勻培養(yǎng),分別轉(zhuǎn)種MACI、SS、MAC和VRBGA平板培養(yǎng)。挑取可疑菌落,涂片革蘭氏染色,應(yīng)用VITEK 2全自動生化鑒定儀的GN-菌種鑒定卡對革蘭氏陰性桿菌進(jìn)行鑒定。檢測過程中,均帶標(biāo)準(zhǔn)菌株作參考。
1.3.3 MACI培養(yǎng)基的應(yīng)用效果評判 基本程序同1.3.2。分別將MAC、SS、VRBGA、MACI分離到的可疑菌落數(shù)與生化鑒定確認(rèn)的菌落數(shù)進(jìn)行比較,計算出各培養(yǎng)基的分離陽性率(分離陽性率=生化鑒定確認(rèn)的菌落數(shù)/可疑菌落數(shù)),并借此對MACI的分離特異性做出評判。
(1)實驗室引進(jìn)菌株經(jīng)VITEK 2鑒定,結(jié)果均符合試驗要求。
(2)通過對試驗菌株菌落的觀察發(fā)現(xiàn),在VRBGA、SS和MAC培養(yǎng)基上,菌落均呈濕潤、光滑、邊緣整齊、紅色的形態(tài)特點,因此,克雷伯菌不易與其他腸桿菌進(jìn)行判讀和鑒別。MACI平板上,試驗菌株進(jìn)行中的克雷伯菌菌株均形成紅色、直徑約2 mm、突起、黏稠、相鄰融合的菌落,其他腸桿菌的菌落為無色,雖然產(chǎn)氣腸桿菌的菌落也為紅色,但相鄰菌落不發(fā)生融合現(xiàn)象。
(3)克雷伯菌在MACI上的生長率。NA是需氧和兼性厭氧菌生長的良好培養(yǎng)基。在此培養(yǎng)基上,肺炎克雷伯菌(ATCC 10031)和產(chǎn)酸克雷伯菌(ATCC13182)不同濃度的菌液均生長良好、計數(shù)變化明顯。由表1可見,當(dāng)菌液稀釋濃度達(dá)到102cfu/ ml時,該菌即可在NA培養(yǎng)基上生長,在MACI培養(yǎng)基上也能達(dá)到很好的生長效果。依據(jù)食品微生物學(xué)檢驗菌落計數(shù)測定的報告原則[20],選擇菌落數(shù)在30~300的稀釋度結(jié)果,以NA培養(yǎng)基為對照,計算出MACI培養(yǎng)基的生長率分別為0.936 6和0.898 8。
(4)最低檢出限。1 ml菌液加入250 ml含有25 g配方奶粉的NB中,菌濃度被稀釋了250倍。表2顯示,兩種菌在104cfu/ ml稀釋度時,均可生長,故MACI平板上的最大稀釋生長濃度為104cfu/250 ml,兩種克雷伯菌的最低檢出限均為40 cfu/g。
(5)市場銷售配方奶粉中克雷伯菌的檢測。表3顯示,在4種不同選擇性培養(yǎng)基分離克雷伯菌的試驗中,MACI的分離陽性率最高,為75.0%,VRBGA和MAC相同,分別為50.0%,SS為37.5%。
表3 不同選擇性培養(yǎng)基分離克雷伯菌效果比較
在腸桿菌科細(xì)菌常用的分離培養(yǎng)基MAC、SS、VRBGA上,克雷伯菌與發(fā)酵乳糖陽性的細(xì)菌菌落均呈紅色,不易區(qū)分。本項目組依據(jù)克雷伯菌可分解側(cè)金盞花醇的特點[17],研制了MACI,經(jīng)測試,克雷伯菌在MACI上可形成特點顯著、易與其他腸桿菌區(qū)分的菌落,依據(jù)《培養(yǎng)基性能測試實用指南》的要求,經(jīng)對MACI培養(yǎng)基進(jìn)行的生長率與最低檢出限試驗結(jié)果表明,肺炎克雷伯菌(ATCC10031)和產(chǎn)酸克雷伯菌(ATCC13182)在該培養(yǎng)基上的生長率及最低檢出限均符合預(yù)期效果。
對市場銷售的98份嬰幼兒配方奶粉的檢測結(jié)果表明,MACI對克雷伯菌的分離陽性率高于其他3種培養(yǎng)基,經(jīng)對4種選擇性培養(yǎng)基組份對比分析,SS瓊脂的抑菌劑成分最多,達(dá)4種,且含量高[19],而VRBGA瓊脂為2種[21],MAC和MACI瓊脂僅為1種,且含量都較低[19],是否可以認(rèn)為,培養(yǎng)基中抑菌劑成分的多寡、含量的高低和可疑菌落挑選是造成克雷伯菌分離效率差異的原因。我們認(rèn)為MACI培養(yǎng)基為克雷伯菌分離培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。
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G424.31
B
1671-1246(2014)07-0114-03
注:本文系2010年甘肅省衛(wèi)生行業(yè)計劃項目(GSWST-2010-25)