人卵巢顆粒細(xì)胞上胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子受體表達(dá)的相關(guān)性研究

梁瑩 李淑賢 米梅艷 周莉 吳曉茜 雷靈梅

卵母細(xì)胞及其周圍的顆粒細(xì)胞和卵泡液同處一個(gè)卵泡微環(huán)境中，卵母細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、卵丘顆粒細(xì)胞以及壁層顆粒細(xì)胞之間彼此有著許多縫隙連接，并且交流信息，功能互相聯(lián)系成為一個(gè)整體。在卵母細(xì)胞發(fā)育成熟和顆粒細(xì)胞分化過(guò)程中，卵泡內(nèi)的這種細(xì)胞間的聯(lián)系，尤其是局部的自分泌、旁分泌的細(xì)胞因子的作用，是非常重要的。所以，在卵母細(xì)胞質(zhì)量的研究中，對(duì)顆粒細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的研究受到了廣泛關(guān)注［1，2］。胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin/insulin-like growth factor 1，INS/IGF-1)信號(hào)通路是卵巢內(nèi)重要的信號(hào)通路之一［3-5］。本研究旨在檢測(cè)人顆粒細(xì)胞上胰島素受體(insulin receptor，INSR)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)的表達(dá)，比較不同妊娠結(jié)局組別INSR的表達(dá)差異及其與血清性激素的關(guān)系，探討顆粒細(xì)胞上INSR和IGF-1R的生理意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心2010年9月至2011年6月接受IVF-ET治療不孕癥患者84例，年齡23～39歲，平均年齡(29.6±2.0)歲。按照妊娠結(jié)局分為妊娠組和未妊娠組。每組42例。妊娠組42例，年齡23～39歲，平均年齡(29.3±4.0)歲;未妊娠組42例，年齡24～39歲，平均(29.1±3.2)歲。2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。該研究經(jīng)石家莊市第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)(1)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合診斷標(biāo)準(zhǔn);②基礎(chǔ)促卵泡刺激素(Basal Follicle-stimulating Hormone，BFSH)＜10 mU/ml;③年齡 ＜40歲;④簽訂知情同意書。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①子宮無(wú)妊娠能力或者嚴(yán)重軀體疾病不能妊娠;②接觸致畸量的毒物、射線并處作用期;③有嚴(yán)重的精神疾病;④性傳播疾病;⑤泌尿生殖系統(tǒng)炎癥;⑥有吸毒等嚴(yán)重不良嗜好;⑦子宮內(nèi)膜異位癥。

1.3 治療方法 常規(guī)長(zhǎng)方案促排卵治療。月經(jīng)的第20天或者黃體中期給予醋酸曲普瑞林(Triptorelin Acetate，0.1mg/支，法國(guó)博福益普生，D22863)0.1 mg·支-1·d-1，皮下注射，14～18 d。當(dāng)達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，即子宮內(nèi)膜5 mm，血清雌二醇(E2)＜50 pg/ml后，給予重組人促卵泡激素(Gonal-F，果那芬，75 U/支，默克雪蘭諾，AU002290)250～300 U/d，皮下注射，觀察B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況及血清黃體生成素(Luteinizing Hormone，LH)、雌二醇(Estradiol，E2)、孕酮(Progesterone，P)水平，當(dāng)60%的優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18 mm時(shí)停藥，于20∶00～21∶00給予重組絨促性素250 g(艾澤，250 g/支，默克雪蘭諾，DA009256)，皮下注射，誘導(dǎo)卵泡成熟，36～38 h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵。

1.4 方法及觀察指標(biāo)

1.4.1 顆粒細(xì)胞的提取:留取直徑18～20 mm的優(yōu)勢(shì)卵泡的卵泡液，1 500 r/min離心10 min，加入PBS至5 ml制成混懸液。另取15 ml離心管，加入人淋巴細(xì)胞分離液5 ml，將混懸液緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液的液面上，1 200 r/min離心20 min，吸取在兩液面之間的顆粒細(xì)胞層，并且加入PBS 3 000 r/min離心5 min，下層即為壁顆粒細(xì)胞。加入2 ml Trizol液(invitrogen公司)完全裂解后置于-80℃凍存(用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR)。

1.4.2 性激素的測(cè)定采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫測(cè)定法，美國(guó)ARCHITECT公司提供LH、E2、P試劑盒測(cè)定。按試劑說(shuō)明書同批專人操作。

1.5 卵泡壁顆粒細(xì)胞INSR、IGF-1RmRNA表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。Trizol(Invotrigen公司，美國(guó))一步法提取顆粒細(xì)胞總RNA，取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。然后分別以人GAPDH、INSR、IGF-1R的特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的基因序列，經(jīng)GenBank BLAST進(jìn)行引物序列同源性檢測(cè)，用DNAman version 6軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下:GAPDH-上游:5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3，GAPDH-下 游:5’-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’;INSR-上 游:5’-TGCCCACCATCTGTAAGT-3’，INSR-下游:5’-CGTCCAGGTAGAAGTTGCG-3’;IGF-1R-上游:5’-TGAACTTTCTCCCTCATCGG-3’，IGF-1R-下 游:5’-GCCAGCGTGTCTCTCAAAT-3’;應(yīng)用ABI 7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。INSR、IGF-1RmRNA表達(dá)量以2-△△CT來(lái)表示，其值為以INSR、IGF-1R mRNA表達(dá)量與GAPDH表達(dá)量的比值，再將對(duì)照組某某的量設(shè)為1，其余樣本的數(shù)值與其相除，得到相對(duì)定量值。每個(gè)目的基因測(cè)定重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組臨床指標(biāo)比較 妊娠組血清E2水平高于未妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。妊娠組優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)高于未妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組HCG日血清LH、E2、P水平及獲卵數(shù)、受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率的比較n=42

2.2 2組壁顆粒細(xì)胞INSR、IGF-1R mRNA表達(dá)比較

84例患者壁顆粒細(xì)胞上均有INSR、IGF-1RmRNA表達(dá)。妊娠組INSR、IGF-1R、表達(dá)高于未妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組壁顆粒細(xì)胞INSR、IGF-1RmRNA表達(dá)比較n=42，±s

表2 2組壁顆粒細(xì)胞INSR、IGF-1RmRNA表達(dá)比較n=42，±s

注:與未妊娠組比較，*P＜0.05

INSRmRNAIGF-1R mRNA妊娠組0.84±0.14*0.79±0.14組別*未妊娠組0.39±0.090.41±0.12

2.3 相關(guān)性分析INSR與IGF-1R呈正相關(guān)(r=0.712，P＜0.01);INSR、IGF-1R表達(dá)與血清LH、E2、P水平無(wú)相關(guān)性(r值分別為0.005、0.305、0.272、0.076、0.274、0.2992，P＞0.05)。

3 討論

INS/IGF-1信號(hào)通路是卵巢內(nèi)重要的信號(hào)通路之一。關(guān)于這一信號(hào)通路目前研究較多的是卵泡液，研究顯示，卵泡液中IGF-1和IGFBP-1的濃度與卵母細(xì)胞的質(zhì)量呈正相關(guān)［6］，血清和卵泡液中IGF/IGFBP的比率，妊娠女性比未妊娠者高［7］，提示這個(gè)比率是評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量的有效參數(shù)。本研究對(duì)顆粒細(xì)胞上膜受體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞INSR、IGF-1R的表達(dá)妊娠組高于未妊娠組，證明卵泡內(nèi)的INS/IGF-1信號(hào)通路是通過(guò)對(duì)顆粒細(xì)胞的調(diào)控影響卵母細(xì)胞發(fā)育的。INSR、IGF-1R兩者具有相關(guān)性，提示兩者在同一信號(hào)通路上，功能相關(guān)，而且INSR、IGF-1R與血清的性激素的水平無(wú)相關(guān)性，提示INSR、IGF-1R不直接受到性激素的調(diào)節(jié)。細(xì)胞膜受體表達(dá)的增加也增強(qiáng)IGF-1等信號(hào)因子的功能，因而與既往的研究結(jié)果［6，7］一致。因而顆粒細(xì)胞INSR表達(dá)的增加，可以增強(qiáng)insulin的功能促進(jìn)卵泡內(nèi)對(duì)葡萄糖的攝取，促進(jìn)卵泡內(nèi)糖酵解過(guò)程為卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟提供能量。還有研究顯示IGF-1及其受體對(duì)FSH刺激的顆粒細(xì)胞分泌雌激素的關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)也是非常重要的［8］。綜上所述，本研究結(jié)果顯示顆粒細(xì)胞上INSR、IGF-1R的表達(dá)可能對(duì)顆粒細(xì)胞的卵巢內(nèi)糖酵解和分泌功能都具有重要的作用，從而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟。

病理研究顯示，多囊卵巢綜合征多伴有胰島素抵抗，在卵巢局部INS/IGF-1信號(hào)通路的異常，導(dǎo)致了多囊卵巢綜合征患者卵子質(zhì)量下降、局部的病理的形成。研究顯示，高劑量的胰島素會(huì)誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，葡萄糖明顯受影響，因而證明高胰島素可以影響葡萄糖利用，削弱卵泡的糖酵解作用，減少能量的供應(yīng)，從而影響卵泡生長(zhǎng)成熟［9］。IGF-2在優(yōu)勢(shì)卵泡的卵泡液及顆粒細(xì)胞中的高表達(dá)，表明它在在卵泡發(fā)育和對(duì)優(yōu)勢(shì)卵泡成熟有重要作用［10］。IGF系統(tǒng)與高胰島素密切相關(guān)，高胰島素可以減少IGF結(jié)合蛋白(insulin likegrowth binding proteins，IGFBPs)合成，增加游離的IGF-1［11］，增多的游離IGF-1下調(diào)IGF-1受體表達(dá)。因?yàn)镮GF-1受體通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8(glucose transporter 8，GLUT-8)通道促進(jìn)糖吸收，所以IGF-1受體下調(diào)導(dǎo)致卵泡糖吸收障礙，發(fā)育障礙。而本研究通過(guò)對(duì)比顆粒細(xì)胞INSR、IGF-1R和妊娠的關(guān)系，直接證明了卵巢局部INS/IGF-1信號(hào)的異常影響了卵母細(xì)胞的質(zhì)量，也與以上對(duì)多囊卵巢綜合征卵巢病理的研究結(jié)論相一致，更有力的證明了INS/IGF-1信號(hào)在卵巢功能中的重要作用。

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