促紅細(xì)胞生成素對(duì)急性心肌缺血再灌注后大鼠心肌凋亡基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

康利鴿 何雪輝 田春鳳 李昕 劉蘭英

研究表明，促紅細(xì)胞生成素(EPO)可對(duì)心肌損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，并可抑制心室重構(gòu)，但其確切的機(jī)制尚不清除［1，2］。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠心肌缺血再灌注模型，觀察EPO對(duì)急性心肌缺血再灌注心肌凋忘基因表達(dá)的影響，探討EPO的心臟保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Sprague Dawley大鼠36只，清潔極，12～15周齡，體重210～260 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，按清潔極大鼠的要求飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。

1.2 方法 通過阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支血流建立缺血再灌注模型。大鼠稱重，經(jīng)10%水合氯醛麻醉(3.0 ml/kg腹腔內(nèi)注射)。經(jīng)口氣管插管接小動(dòng)物呼吸機(jī)，潮氣量約為30 ml，通氣頻率90次/min。去前胸正中切口，在3～4肋間進(jìn)入胸腔，分離心包，從劍突下方向胸腔方向從兩側(cè)胸壁后方向上方適度擠壓，使心臟跳出胸腔，在右心室流出道與左心房之間，據(jù)主動(dòng)脈根部2 mm處用絲線(6-0)穿過左冠狀動(dòng)脈前降支，用線管法阻斷冠脈血流。阻斷后顯示左心室壁變白，并出現(xiàn)室壁變白，心電圖I、avL導(dǎo)聯(lián)S-T段明顯抬高(＞1 mV)，表明阻斷成功，45 min后，松開絲線實(shí)施再灌注，保留絲線，逐層縫合，自主呼吸平穩(wěn)后，撤掉呼吸機(jī)，拔出氣管插管。假手術(shù)組(Sham組)只穿線繞過冠狀動(dòng)脈前降支而不阻斷血流。術(shù)后大鼠保溫，單籠放置，待清醒后再次稱重，編號(hào)，按組分籠飼養(yǎng)。

1.3 分組36只大鼠隨即分為3組，每組12只:(1)假手術(shù)組(Sham組):0.9%氯化鈉溶液1 ml，直接腹腔注射，1次/d，共3 d。(2)缺血再灌注組(IR組):0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，1次/d，手術(shù)前連續(xù)3 d。(3)EOP組:EPO以3 000 U/kg直接腹腔注射，1次/d，手術(shù)前連續(xù)前3 d(濟(jì)脈欣，河北省石家莊市華北制藥廠生產(chǎn))。

1.4 取材

1.4.1 染色:大鼠麻醉后迅速開胸，結(jié)扎保留絲線后，從下腔靜脈注入伊文氏藍(lán)2 ml。并靜脈注射10%氯化鉀溶液使心臟停跳于舒張末期，取出心臟，在4℃經(jīng)高壓處理的DEPC水中洗去殘余血液，剪除多余血管及心房組織，分割左右心室(左心室包括室間隔部分)。藍(lán)染區(qū)為正常灌注區(qū)，非藍(lán)染區(qū)為缺血梗死期，非藍(lán)染區(qū)中的淡染區(qū)為邊緣區(qū)。

1.4.2 測(cè)定心肌梗死面積:自心尖部到結(jié)扎線沿心臟長(zhǎng)軸將心肌組織分為5片，每片厚度1～2 mm，取第3片行TTC染色。將心肌組織切片放于2%TTC染色中，37℃溫浴30 min，取出后清水沖洗，白色部分為梗死區(qū)域。梗死面積(%)=TTC染色梗死區(qū)面積∕伊文氏藍(lán)染色的缺血梗死區(qū)面積。

1.4.3 TTC染色:取材完畢后邊緣區(qū)心肌組織約100 mg，冰上操作。立即放入液氮速凍，于-80℃冰箱中保存，用于mRNA基因檢測(cè)，另取邊緣梗死區(qū)為150 mg左右兩塊，放入10%甲醛溶液中，4℃冰箱保存，用于HE染色及免疫組化染色。

1.4.4 免疫組化染色:Bcl-2、Bax、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白在細(xì)胞漿及細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，陽性反應(yīng)均呈棕黃色或黃色。數(shù)據(jù)采集應(yīng)用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，在相同的放大倍數(shù)下，每個(gè)切片計(jì)數(shù)10個(gè)視野，計(jì)算陽性染色算占面積。Bcl-2、Bax、VEGF以陽性細(xì)胞染色的平均光密度值(OD)表示抗原表達(dá)量。

1.5 用RT-PCR方法測(cè)定Bcl-2mRNA、BaxmRNA流程

1.5.1 主要儀器:美國(guó)PE公司Geneamp 9600型PCR儀，德國(guó)賀利氏公司RS-28高速低溫離心機(jī)，德國(guó)Gilson微量移液器，美國(guó)UVP公司UVP凝膠掃描系統(tǒng)，國(guó)產(chǎn)DYY-Ⅲ橋式電泳儀等。

1.5.2 主要試劑:RNA提取試劑Trizol Reagent(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT)，核糖核酸酶抑制劑(RNasin)，dNTP、Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)、隨機(jī)引物、瓊脂糖(agarose)均購(gòu)自美國(guó)Promega公司。逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)流程如下。

1.5.3 目的基因引物的合成:引物序列依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。大鼠Bcl-2引物序列:PCR 7.02 bp上游引物:5’-CAAGAATGCAAAGCACATCC-3’編號(hào)1106-371;下游引物:5’-ATCCCAGCCTCCGTTATCC-3’編號(hào)1106-372;大鼠Bax引物序列:PCR 407 bp;上游引物:5’-GGCTGGCAAGGTCACTGTCT-3’編號(hào)1106-373;下游引物:5’-AGCCACAAAGATGGTCACTGTCT-3’編號(hào)1106-374;大鼠心肌組織總RNA提取:取組織100 mg，嚴(yán)格按說明書規(guī)定步驟提取總RNA英語Qyant一步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增。見表1。

PCR熱循環(huán)參數(shù):β-actin和Bcl-2、Bax基因擴(kuò)增條件為:50℃30 s，94℃2 min，然后94℃60 s，58℃60 s，65℃90 s(33個(gè)循環(huán))，65℃延伸10 min。擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)同時(shí)擴(kuò)增鼠β-actin用作內(nèi)參照。

1.5.4 RT-PCR產(chǎn)物半定量:取RT-PCR產(chǎn)物4 μl，加上樣緩沖液1 μl，在1.5%瓊脂糖凝膠(含EB)上電泳，80 V，45 min，用UVP凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝打印實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Gel-Pro Analyzer Version 3.0)分析后果。以樣本顯示的灰度值與β-actin的灰度值之比作為樣本mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織邊緣區(qū)HE染色形態(tài)學(xué)觀察 與Sham組比較，IR組48 h、2周可見結(jié)構(gòu)被明顯破壞，心肌纖維水腫、溶解斷裂、壞死甚至融合成大片狀，膠原網(wǎng)絡(luò)破壞，心肌細(xì)胞間結(jié)締組織大量增多，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌纖維化等。與IR組比較，EPO組在48 h、2周時(shí)上述形態(tài)學(xué)改變均明顯減輕。

2.2 心肌梗死面積比較 與IR組比較，手術(shù)后24 h心肌梗死減少27.9%(43%對(duì)31%，P＜0.01)。

2.3 邊緣區(qū)Bcl-2、Bax和VEGF的表達(dá) 與IR組比較，EPO組Bcl-2蛋白表達(dá)在48 h、2周分別為27.7%、31.4%;Bax蛋白表達(dá)在48 h、2周均降低，分別降低為20.9%、18.0%(P＜0.01)。Bcl-2/Bax比值在個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著增高(P＜0.05);與IR組比較，EPO組Bcl-2mRNA各時(shí)間點(diǎn)均顯著增高，BaxRNA各時(shí)間點(diǎn)均顯著下降(P＜0.01)。。EPO組VEGF蛋白表達(dá)在48 h、2周均增高，分別增高22.1%、21.4%(P＜0.05或 ＜0.01)。見表1～3。

表1 邊緣區(qū)Bcl-2與Bax的蛋白表達(dá)n=6，±s

表1 邊緣區(qū)Bcl-2與Bax的蛋白表達(dá)n=6，±s

組別Bcl-2蛋白表達(dá)48 h2周蛋白表達(dá)48 h2 Bax周Sham組0.13±0.0210.13±0.0200.13±0.0210.13±0.022 IR組0.07±0.0140.08±0.0160.23±0.0260.21±0.023 EPO組0.10±0.0170.11±0.0140.18±0.0170.17±0.016

表2 邊緣區(qū)Bcl-2與BaxmRNA的相對(duì)表達(dá)n=6，±s

表2 邊緣區(qū)Bcl-2與BaxmRNA的相對(duì)表達(dá)n=6，±s

組別Bcl-2mRNA 表達(dá)48 h2周表達(dá)48 h2 BaxmRNA周Sham組0.086±0.0110.87±0.0130.33±0.0260.32±0.024 IR組0.31±0.0210.50±0.0340.81±0.0220.67±0.021 EPO組0.51±0.0260.65±0.0340.72±0.390.62±0.020

表3 邊緣區(qū)VEGF的蛋白表達(dá)n=6，±s

表3 邊緣區(qū)VEGF的蛋白表達(dá)n=6，±s

組別48 h2周Sham組0.095±0.01670.098±0.0176 IR組0.114±0.01200.140±0.0189 EPO組0.139±0.01310.170±0.0163

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，EPO除了促進(jìn)造血功能以外，還具有保護(hù)心血管內(nèi)皮功能，如抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。在培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞缺氧損傷試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入rhEPO的細(xì)胞凋亡率降低50%，證實(shí)EPO具有抗心肌細(xì)胞凋亡的作用［3，4］。本研究采用在體實(shí)驗(yàn)的方法，腹腔注射EPO，觀察其抗凋亡的作用，其結(jié)果是EPO可在心肌損傷的早期和后期顯著抑制促凋亡基因的表達(dá)，并減少損傷后在其心肌梗死的面積。

心肌組織中，抗凋亡基因Bcl-2及促凋亡基因Bax是影響細(xì)胞凋亡非常重要的基因，抗凋亡基因與促凋亡基因的相對(duì)比較在決定存亡中起關(guān)鍵作用［5］。本研究顯示EPO對(duì)2個(gè)基因的影響從缺血再灌注損傷后24 h就發(fā)揮了明顯的調(diào)節(jié)作用，并一直持續(xù)到第2周，而且Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)也發(fā)生了相應(yīng)變化。

VEGF是一種與血管生長(zhǎng)有關(guān)的特異性生長(zhǎng)因子。VEGF生理功能為誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷徙等作用［6］。Yockman等［7］通過VEGF基因治療兔心肌梗死后發(fā)現(xiàn)能減少梗死面積，VEGF保護(hù)機(jī)制就是抑制細(xì)胞凋亡的同時(shí)，還可抑制p53、Fas、Bax蛋白的表達(dá)和增加Bcl-2的表達(dá)。本研究提示EPO可增加VEGF蛋白的表達(dá)，可能是EPO抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

細(xì)胞凋亡在心肌缺血再灌注中起非常重要的作用，抑制缺血的邊緣區(qū)心肌組織的凋亡可有效減少心肌梗死面積，并影響以后心室重構(gòu)的過程［8］，EPO可能通過抑制邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡，或(和)促進(jìn)心肌血管新生減少心肌梗死面積。

1 劉焱，張文亮，李增新.氯沙坦和螺內(nèi)酯及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)心肌梗死大鼠早期新生血管的影響.河北醫(yī)藥，2012，34:1455-1457.

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3 Patel NS，Sharples EJ，Cuzzocrrea S，et al.Pretreatment with EPO reduces the injury and dysfunction caused by ischemia/reperfusion in the mouse kidney in vivo.Kidney Int，2004，66:983-989.

4 Calvillo L，Latini R，Kajstura J，et al.Recombinant human erythropoietin pretects the myocardium from ischemia-reperfusion injury and promotes beneficial renmodeling.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100:4802-4806.

5 Danial NN，Korsmeyer SJ.Cell death:Critical control points.C cell，2004，116:205-219.

6 Vincenti V，Cassano C，Rocchi M，et al.Assignment of the vascuar endothelial growth factor gene to human chromosome 6p21.3.Circulation，1996，93:1493-1495.

7 Yockman JW，Choi D，Whitten MG，et al.Polymeric gene delivery of ischemia-inducible VEGF significantly attenuates infarct size and apoptosis following myocardial infarct.Gene Therapy，2009，16:127-135.

8 Ruixing Y，Jiaquan L，JIE C，et al.Intravenous administration of vascular endothelial growth factor improves caediac performance and inhibits cardiomyocyte apoptosis.Growth Factors，2006，24:209-217.