家兔下腔靜脈血栓模型建立的實(shí)驗(yàn)研究

吳大勇 張文艷 陳江紅 邊艷珠 胡玉敬

肺動(dòng)脈血栓栓塞(pulmonary thromboembolism，PTE)和深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis，DVT)是靜脈血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE)的兩種臨床表現(xiàn)，具有相同的易患因素［1］。PTE的病死率高，嚴(yán)重危害人類健康。DVT是PTE的主要血栓來源。近端深靜脈存在血栓的患者中，約50%患者伴有臨床無癥狀的PTE［2］。70%的PTE患者在下肢深靜脈發(fā)現(xiàn)血栓［3］。DVT的早期診斷及有效治療對(duì)預(yù)防PTE發(fā)生具有重要意義。DVT診斷及治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究離不開靜脈血栓模型，靜脈血栓動(dòng)物模型是DVT實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵一環(huán)。靜脈血管內(nèi)引入異物，通過異物啟動(dòng)凝血過程，可在異物表面附著形成血栓;異物能夠?qū)е卵饔贉?，局部血液形成渦流，促進(jìn)凝血;同時(shí)異物在靜脈血管內(nèi)損傷血管內(nèi)膜，暴露膠原組織，啟動(dòng)內(nèi)源性凝血過程促進(jìn)血栓形成［4］。本實(shí)驗(yàn)選用家兔下腔靜脈，對(duì)利用異物法建立下腔靜脈血栓模型進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)新西蘭家兔30只，體重2.0～2.5 kg，雌雄不限，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào):1009032。3%戊巴比妥鈉注射液河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院惠贈(zèng)。青霉素購(gòu)于石家莊制藥廠。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:將30只實(shí)驗(yàn)兔分為血栓組25只，對(duì)照組5只。血栓組建立下腔靜脈血栓模型，對(duì)照組僅進(jìn)行造模術(shù)相同的手術(shù)過程，但不建立血栓模型。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉:由實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉，注射劑量為1.0～0.3 ml/kg，麻醉成功后，仰臥位四肢伸展固定于手術(shù)臺(tái)。

1.2.3 血栓組下腔靜脈血栓造模方法:實(shí)驗(yàn)兔右側(cè)腹備皮，沿腹直肌右外側(cè)線切開皮膚長(zhǎng)約4～6 cm切口，逐層鈍性分離腹壁肌肉、腹膜。入腹腔后將腸管部分移出，用0.9%氯化鈉溶液浸濕紗布覆蓋腸管，充分暴露右腎下極水平以下下腔靜脈。將自制U形銅絲夾于右腎下極水平包繞下腔靜脈，長(zhǎng)約3 cm直徑約3 mm的自制單股螺旋銅絲向心方向穿刺入下腔靜脈，止血后，將銅絲夾收緊使夾子縫隙約2 mm左右?；丶{腸管，0.9%氯化鈉溶液沖洗腹腔，逐層縫合腹膜、肌肉、皮膚。手術(shù)完畢后于實(shí)驗(yàn)兔臀部肌內(nèi)注射80萬U青霉素。家兔術(shù)后清潔環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2.4 對(duì)照組手術(shù)方法:對(duì)照組進(jìn)行與血栓組相同的手術(shù)過程，只是不在下腔靜脈內(nèi)穿刺置入自制螺旋銅絲，及在下腔靜脈不放置自制U形銅絲夾。

1.2.5 解剖:血栓組與對(duì)照組均于手術(shù)后1 d，注射致死量戊巴比妥鈉處死實(shí)驗(yàn)兔，解剖實(shí)驗(yàn)兔，血栓組觀察血栓形成情況，對(duì)照組觀察下腔靜脈情況。

1.2.6 病理:血栓組處死動(dòng)物后取血栓，0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，紗布粘干，立即至于甲醛溶液中固定，后血栓標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色。

2 結(jié)果

血栓組25只實(shí)驗(yàn)兔造模術(shù)后均存活，一般情況良好。造模術(shù)后1 d處死實(shí)驗(yàn)兔解剖后，所有25只實(shí)驗(yàn)兔下腔靜脈管壁完好，未見破裂出血。23只實(shí)驗(yàn)兔下腔靜脈內(nèi)肉眼可見血栓形成(圖1)，紅色血栓與白色血栓沿螺旋銅絲相間附著(圖2)，下腔靜脈回流尚通暢，造模成功率92%(23/25)。2只實(shí)驗(yàn)兔未觀察到下腔靜脈血栓形成，下腔靜脈回流通暢，系由于自制U形銅絲夾脫落，螺旋銅絲沿下腔靜脈隨血流上行嵌頓于右心房。

對(duì)照組5只實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后均存活，一般情況良好。術(shù)后1 d處死實(shí)驗(yàn)兔解剖后觀察，可見下腔靜脈均回流通暢，下腔靜脈內(nèi)未見血栓形成(圖1)。

血栓組血栓病理證實(shí)均為新鮮混合血栓(圖2)，紅色血栓與白色血栓間或存在，病理切片經(jīng)HE染色，顯微鏡下見淡紅色珊瑚狀血小板小梁，小梁間纖維素網(wǎng)內(nèi)包含大量紅細(xì)胞，血小板小梁邊緣有較多中性粒細(xì)胞粘附。

圖1 血栓組與對(duì)照組解剖后下腔靜脈照片

圖2 血栓大體標(biāo)本與病理照片

3 討論

DVT是血液在深靜脈內(nèi)異常凝集導(dǎo)致的靜脈血液回流障礙性疾病，靜脈血栓脫落阻塞肺動(dòng)脈便引起PTE，PTE嚴(yán)重者影響患者生活質(zhì)量甚至導(dǎo)致死亡。DVT是臨床多發(fā)的一種疾患，主要成因?yàn)殪o脈血管壁損傷、血流緩慢和血液高凝狀態(tài)，常繼發(fā)于長(zhǎng)時(shí)間靜坐、長(zhǎng)期臥床、肢體制動(dòng)、大手術(shù)創(chuàng)傷后或晚期腫瘤患者［5］。對(duì)DVT診斷或治療的研究對(duì)于預(yù)防PTE具有重要意義，靜脈血栓動(dòng)物模型的建立是對(duì)DVT診斷或治療進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。

研究報(bào)道中血栓模型的常用造模方法有三種。(1)通過損傷血管內(nèi)膜暴露內(nèi)膜下膠原激活凝血過程［6-8］。常見方法為在DSA下將導(dǎo)管穿刺插入血管，通過抽拉導(dǎo)絲或球囊來損傷血管內(nèi)膜，此方法內(nèi)膜損傷效果好，但需用到DSA機(jī)及需要導(dǎo)管介入操作技術(shù)，對(duì)于一般實(shí)驗(yàn)小組較難實(shí)現(xiàn)。另也可手術(shù)暴露深靜脈利用血管鉗夾壓靜脈血管來損傷血管內(nèi)膜［9，10］，但通過血管外加壓損傷血管內(nèi)膜的效果差。(2)人為制造血管局部血流淤滯導(dǎo)致凝血［11］。常見方法為手術(shù)暴露靜脈血管利用手術(shù)縫線結(jié)扎血管，造成局部血液淤滯。血液淤滯形成的血栓多為紅色血栓，人類形成的靜脈血栓早期及中期多為混合血栓，只有在混合血栓阻塞血管后，在血栓尾端才形成紅色血栓［12］。張鵬等［13］利用導(dǎo)管介入技術(shù)通過球囊加壓阻塞血管，建立的犬下肢深靜脈血栓模型，血栓病理顯示以紅色血栓為主。(3)通過血管內(nèi)置入異物啟動(dòng)凝血過程。目前已有多篇報(bào)道［14］通過導(dǎo)管介入技術(shù)，將螺旋銅絲等異物置入靜脈血管建立血栓模型的報(bào)道。Wei等［15］利用導(dǎo)管將自制螺旋銅絲送入犬股靜脈，成功建立了股靜脈血栓模型。上述方法需利用DSA機(jī)及需要介入操作技術(shù)，一般科研人員較難實(shí)現(xiàn)。

本研究通過手術(shù)暴露下腔靜脈，將自制螺旋銅絲穿刺置入下腔靜脈，螺旋銅絲為異物激活凝血過程，也導(dǎo)致局部血流緩慢，另螺旋銅絲刺激損傷局部血管黏膜，啟動(dòng)內(nèi)源性凝血過程，促進(jìn)血栓形成。于螺旋銅絲近心端下腔靜脈血管放置自制U形銅絲夾，固定螺旋銅絲，同時(shí)起到部分阻斷血流，導(dǎo)致局部血流瘀滯的作用，也利于血栓形成。該方法具有較高的成功率，實(shí)驗(yàn)中成功建立下腔靜脈血栓模型23只，成功率92%(23/25)。造模術(shù)后1 d，實(shí)驗(yàn)兔下腔靜脈內(nèi)螺旋銅絲可見紅白相間沿銅絲分布的混合血栓。HE染色病理證實(shí)了血栓均為混合血栓。

文獻(xiàn)報(bào)道中常用于造模的動(dòng)物有犬、家兔及大鼠。犬的血管較粗，容易操作，但價(jià)格昂貴;大鼠價(jià)格低廉，但血管較細(xì)，不容易操作，手術(shù)或介入方法都難度較大;家兔的下腔靜脈較粗，且價(jià)格適中，大樣本量的實(shí)驗(yàn)是較合適的選擇。

本方法造模成功率高，血栓病理符合深靜脈血栓特點(diǎn)，所建立靜脈血栓模型可以用于靜脈血栓的影像診斷、溶栓治療及病理生理等研究，本方法無需借助DSA等大型儀器設(shè)備，也未利用導(dǎo)管介入技術(shù)等高難度操作，一般的科研工作人員較易獨(dú)立完成。

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