視神經(jīng)脊髓炎患者血清水通道蛋白4抗體水平與臨床特征的相關(guān)性

王靜 楊麗 楊春生 李婷 張大啟 齊媛 高春麗

視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitits optica，NMO)，又稱Devic病，是視神經(jīng)和脊髓同時(shí)或相繼受累的急性或亞急性脫髓鞘病變，與多發(fā)性硬化同屬中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病。2004 年，Lennon等[1]通過間接熒光免疫法檢測(cè)到NMO患者血清中有一種特異性自身抗體NMO-IgG,其敏感性為73%,特異性為91%,而在多發(fā)性硬化患者血清中該抗體檢測(cè)陰性。2005年Lennon等[2]發(fā)現(xiàn)水通道蛋白4(aquaporin-4，AQP-4)為NMO-IgG的靶抗原，進(jìn)一步證明了NMO是一種自身免疫性水通道病。2006年，Wingerchuk等[3]在修訂NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)中將血清AQP-4抗體陽性列為NMO支持診斷依據(jù)。目前NMO臨床診斷及研究中多用AQP-4抗體的定性檢測(cè)，而其定量檢測(cè)研究較少。本文利用熒光免疫沉淀法(fluorescence immunoprecipita-tion assay, FIPA)檢測(cè)了78例NMO患者AQP-4抗體水平，旨在探討其抗體水平與臨床特征的相關(guān)性。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象均為來自于2010-11-2013-05天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)免疫中心就診及隨訪的78例NMO患者。所有入組NMO患者符合2006年Wingerchuk等修訂的NMO疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。75例患者行脊髓MRI檢查，64例患者行頭MRI 掃描，所有患者均行免疫熒光整細(xì)胞染色法[4](cell-based assay，CBA)檢測(cè)血清AQP-4抗體。10名健康對(duì)照來自于體檢中心健康志愿者。清晨空腹采集靜脈血，離心后血清凍存于-80°C冰箱備用。對(duì)于患者均于急性期未接受大劑量免疫抑制劑治療時(shí)采集血標(biāo)本,采血同時(shí)進(jìn)行EDSS評(píng)分。

1.2方法回顧性分析NMO患者的臨床、影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室資料，應(yīng)用FIPA檢測(cè)血清AQP-4抗體并分析AQP-4抗體水平與臨床特征的相關(guān)性。

1.2.1試驗(yàn)材料：增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)標(biāo)記的人AQP-4(EGFP-AQP-4) M23質(zhì)粒由牛津大學(xué)臨床神經(jīng)科惠贈(zèng)，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Solarbia公司，聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)、去蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail,PIC)、瓊脂糖凝膠4B蛋白A(protein A-sepharose 4B)均購(gòu)自Sigma公司，小牛血清、超低IgG胎牛血清均購(gòu)自GIBCO公司。SYNGERY 2酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-teck公司，倒置顯微鏡為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.2.2AQP-4抗體檢測(cè)[5-7]：(1)175 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)人胚腎293(human embryonic kidney293，HEK293)細(xì)胞；待細(xì)胞貼壁且匯合度達(dá)50%，PEI介導(dǎo)將EGFP-AQP-4 M23 cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。待轉(zhuǎn)染效率至70%以上后加入細(xì)胞裂解液(10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5, 100 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1% Triton X-100,使用前混入1∶100 PIC)裂解細(xì)胞，離心獲取含EGFP-AQP-4蛋白的上清液。測(cè)定熒光值(fluorescent unit,FU)，并將FU值調(diào)整到500～600/200 μL上清液。(2)解凍待測(cè)血清，離心后取待測(cè)血清20 μL，加入EGFP-AQP-4 200 μL，4 ℃輪轉(zhuǎn)過夜后向混合液中加入Protein A-Sepharose 4B 75 μL(經(jīng)超低IgG胎牛血清封閉預(yù)處理)，室溫輪轉(zhuǎn)2 h；以3000 r/min離心1 min，去上清。用1 mL細(xì)胞裂解液漂洗沉淀，重復(fù)3次，加入150 μL 裂解液重懸沉淀的復(fù)合物，加入96孔酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀上獲取FU值。所用激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)507 nm。以健康對(duì)照平均FU+3s為標(biāo)準(zhǔn)值，大于標(biāo)準(zhǔn)值定為陽性。每份血清重復(fù)檢測(cè)3遍，取3次均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用率表示，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示。采用Spearman相關(guān)性分析AQP-4抗體水平與臨床特征的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1臨床特征分析78例NMO患者中，男性12例(15.4%)，女性66例(84.6%)；病程為4個(gè)月～34年，中位數(shù)為5年，四分位數(shù)間距為69.25個(gè)月；起病年齡為15～80歲，中位數(shù)為42歲，四分位數(shù)間距為23.25歲；復(fù)發(fā)次數(shù)為0～10次，中位數(shù)為2次，四分位數(shù)間距為2次；其中，以視神經(jīng)炎起病者31例(39.7%)，以脊髓炎起病者40例(51.3%)，兩者同時(shí)發(fā)生者4例(5.1%)，以其他癥狀起病者3例(3.9%)。血標(biāo)本采集于首次發(fā)病期的28例，復(fù)發(fā)期的50例；復(fù)發(fā)前最后一次隨訪EDSS評(píng)分為2.74±1.20；采集標(biāo)本時(shí)脊髓受累節(jié)段數(shù)為1～16，中位數(shù)為5，四分位數(shù)間距為4；腦部脫髓鞘病灶數(shù)為0～23個(gè)，中位數(shù)為1.5個(gè)，四分位數(shù)間距為5.25個(gè)； AQP-4抗體的檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)值(FU)為8,檢出AQP-4抗體陽性率為73.1%(圖1)。

圖178例NMO患者及10例健康對(duì)照者血清AQP-4抗體FU值分布

2.2AQP-4抗體水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析采集標(biāo)本時(shí)的EDSS評(píng)分、脊髓受累節(jié)段數(shù)、頭MRI病灶數(shù)均與血清AQP-4抗體FU值呈非線性正相關(guān)，采集標(biāo)本后的下一次復(fù)發(fā)間隔時(shí)間與血清AQP-4抗體FU值無相關(guān)性(圖2)。

圖2AQP-4抗體FU值與臨床指標(biāo)的相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討論

本研究采用FIPA方法檢測(cè)78例NMO患者血清AQP-4抗體水平，發(fā)現(xiàn)血清AQP-4抗體水平與EDSS評(píng)分、脊髓受累節(jié)段數(shù)、顱內(nèi)病灶數(shù)有一定的相關(guān)性。 近年來研究提示AQP-4抗體致病的可能機(jī)制為：NMO-IgG與AQP-4胞外區(qū)接合造成AQP-4表達(dá)缺失，從而導(dǎo)致血-腦脊液屏障的滲透性提高；NMO-IgG的主要成分IgG1和四聚體結(jié)構(gòu)的AQP-4成為有效的補(bǔ)體激活因子，募集粒細(xì)胞，粒細(xì)胞進(jìn)入血-腦脊液屏障后，產(chǎn)生抗體依賴的細(xì)胞毒作用和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡；AQP-4內(nèi)化的同時(shí)造成了興奮性毒物的累積，進(jìn)而造成少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷和髓鞘完整性破壞[8-11]。研究表明，AQP-4抗體很可能為NMO的致病性抗體，故推測(cè)其抗體水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。但目前的研究結(jié)論不盡一致。Takahashi等[12]利用CBA法發(fā)現(xiàn)AQP-4抗體滴度水平越高，患者失明會(huì)越完全，MRI脊髓受累節(jié)段數(shù)越多。而Hinson等[13]采用間接免疫熒光法檢測(cè)AQP-4抗體，回顧分析了12例NMO-IgG陽性NMO患者，發(fā)現(xiàn)殘疾程度(失明或癱瘓)重、預(yù)后差的NMO患者與殘疾程度輕、預(yù)后好的患者比較，其NMO-IgG水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。作者推測(cè)造成上述研究結(jié)果不一致的原因可能與檢測(cè)方法不同有關(guān)，也不除外樣本量、采血時(shí)機(jī)對(duì)研究結(jié)果的影響。

目前存在多種AQP-4抗體檢測(cè)的方法：間接免疫熒光法、CBA、FIPA、放射免疫沉淀法、酶聯(lián)免疫吸附法、流式細(xì)胞分析法。FIPA的原理在于：將EGFP標(biāo)記的AQP-4 cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，細(xì)胞裂解后得到EGFP-AQP-4游離蛋白；含有AQP-4抗體的血清與EGFP-AQP-4抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物,復(fù)合物被Protein A沉淀，熒光讀板機(jī)獲得熒光值。熒光值與抗體滴度直線相關(guān)[5，7]，可以精確反映抗體水平。CBA是將AQP-4 M23 cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，血清中的抗體與細(xì)胞表面表達(dá)的AQP-4抗原結(jié)合，并通過熒光顯微鏡讀取熒光二抗標(biāo)記的已結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物[7]。目前認(rèn)為CBA法檢測(cè)AQP-4抗體的敏感性和特異性最高，但CBA法不適于批量檢測(cè)，且不能定量檢測(cè)。該研究在臨床診斷中引用了CBA法，而利用FIPA定量檢測(cè)AQP-4抗體來分析抗體與臨床病情相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示AQP-4抗體水平與NMO病情有一定相關(guān)性，提示AQP-4抗體水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，由于疾病病情受多種因素影響，故AQP-4抗體水平與疾病嚴(yán)重程度的確切關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。目前，血清AQP-4抗體水平與頭MRI病灶數(shù)目相關(guān)性分析的研究較少。既往研究表明，超過5O%的NMO存在顱內(nèi)病變，其特征性病變位于下丘腦、三腦室、導(dǎo)水管、腦橋被蓋及四腦室周圍等AQP-4高表達(dá)區(qū)[14-15]，且尚有NMO廣泛腦部病變的報(bào)道，認(rèn)為其可能與AQP-4相關(guān)的血管源性水腫有關(guān)[12，16-17]。該研究發(fā)現(xiàn)AQP-4抗體水平與顱內(nèi)病灶數(shù)呈正相關(guān)，提示AQP-4抗體可能是形成顱內(nèi)病灶的主要原因。

本研究結(jié)果顯示，患者急性期血清AQP-4抗體水平與至下次復(fù)發(fā)間隔時(shí)間無明顯相關(guān)，提示單次血清AQP-4抗體水平預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的意義可能不大。但多數(shù)研究表明，AQP-4抗體陽性的患者與陰性患者相比，更易出現(xiàn)疾病的復(fù)發(fā)[18],且血清NMO-IgG水平明顯提高往往早于NMO復(fù)發(fā)出現(xiàn)[19]。所以，對(duì)NMO患者密切隨訪，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者血清AQP-4抗體水平，可能對(duì)疾病復(fù)發(fā)的預(yù)警和預(yù)防有重要意義。

由于本研究樣本量較小，有關(guān)AQP-4抗體水平與NMO患者臨床特征的確切關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

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