PPARγ蛋白在人肺高、低轉(zhuǎn)移涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系中的作用

張煒 張玲 王綺 張虎 陳彥平

近年來的研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由癌基因和抑癌基因共同調(diào)控的。過氧化物增殖體激活物受體γ(peroxisome proliferator-activatived receptorsγ，PPARγ)是配體依賴性核激素受體超家族成員之一［1］。大量研究表明，不同部位、多種惡性腫瘤的PPARγ表達(dá)與相應(yīng)的正常組織明顯不同［2］，并且已有PPARγ配體抗腫瘤的臨床試驗研究，這些研究主要集中在乳腺癌，卵巢癌，結(jié)腸癌等［3］。目前關(guān)于PPARγ在口腔涎腺腫瘤領(lǐng)域相關(guān)性的研究極少，與惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的探索也很少。本研究從mRNA和蛋白水平研究PPARγ在涎腺腺樣囊性癌SACC-83及SACC-LM細(xì)胞中的表達(dá)，探討PPARγ與涎腺腺樣囊性癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) SACC-83及SACC-LM細(xì)胞系由北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔外科實驗室提供。細(xì)胞加10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司。PPARγ的引物(上游:5’-ATGGCAATTGAATGTCGTGTC-3’，下游:5’-TCCGCCCAAACCTGATG-3’)及管家基因 gapdh(上游:5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3’，下游:5’-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3’)購自上海生物工程技術(shù)公司。

1.3 RT-PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)在Biometra熱循環(huán)儀中進(jìn)行。PCR產(chǎn)物行210%瓊脂糖凝膠(含0.125 μg/ml EB)電泳鑒定，反映 PPARγ mRNA 在SACC-83和SACC-LM細(xì)胞系中的表達(dá)。

1.4 實時定量PCR(Quantitative Real-time PCR)方法于 PCR 管 中 加 入 10 ×Buffer 215 μl，dNTP(215 mmol/L)，上游引物和下游引物各 1 μl，Taq DNA聚合酶 0.15 μl，DNA 模板 1 μl，2 × Eva(熒光染料)1 125 μl，ddH2O 25 μl。反應(yīng)條件:95℃ 預(yù)變性 15 s;56℃退火20 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次;對擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析特異性，以PPARγ與GAPDH相對濃度的比值來反映PPARγ表達(dá)量。以檢測肺高轉(zhuǎn)移性涎腺腺樣囊性癌(SACC-LM)及肺低轉(zhuǎn)移性涎腺腺樣囊性癌(SACC-83)細(xì)胞系中PPARγ蛋白表達(dá)和PPARγmRNA的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)結(jié)果 通過RT-PCR檢測在SACC-LM細(xì)胞中PPARγmRNA的表達(dá)水平高于SACC-83細(xì)胞。見圖1。

圖1 RT-PCR結(jié)果

2.2 實時定量(Quantitative Real-time)RT-PCR對RTPCR結(jié)果的驗證 為了對RT-PCR的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗證，我們采用Quantitative Real-time RT-PCR的方法對同批RNA進(jìn)行了檢測。實驗結(jié)果表明，QRT-PCR的結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果一致。見表1。

表1 實時定量RT-PCR檢測結(jié)果

3 討論

腺樣囊性癌是發(fā)生在涎腺最常見的惡性腫瘤之一，也是頭頸部極易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高達(dá)40%［4］。不少學(xué)者針對腺樣囊性癌的轉(zhuǎn)移做了大量的工作，但多為針對單一因素的探索，不能全面的反映腫瘤的轉(zhuǎn)移的真實情況。PPARγ作為目前研究最成熟的核激素受體，有上百種天然及人工合成配體，部分配體已經(jīng)應(yīng)用于臨床［5］，腫瘤轉(zhuǎn)移的復(fù)雜性決定了轉(zhuǎn)移是一個多基因共同參與的復(fù)雜過程，PPARγ在涎腺腺樣囊性轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中的表達(dá)為研究腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因提供了條件。

近年來對于涎腺腺樣囊性癌的研究多集中于病理學(xué)和免疫組化的方法。而本實驗運用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，相比于病理學(xué)和免疫組化等方法有特異性高、靈敏度能夠達(dá)到對單個分子的檢測、準(zhǔn)確性方面，盡管達(dá)不到100%的準(zhǔn)確率，但卻在原有方法基礎(chǔ)上大大降低了假陽性率優(yōu)點。

本部分研究采用RT-PCR技術(shù)比較了SACC-LM中PPARγ基因及蛋白水平表達(dá)均明顯高于SACC-83。同時運用實時定量PCR(Quantitative Real-time RTPCR)技術(shù)進(jìn)行驗證，SACC-LM細(xì)胞系與SACC-83細(xì)胞系中 PPAR-γmRNA 表達(dá)水平比值為 4.346939∶1。我們從不同方法的實驗證明，實驗的結(jié)果表現(xiàn)為同步一致性。說明PPARγ在SACC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面起著重要作用。

口腔頜面部惡性腫瘤中，腺樣囊性癌(ACC)極易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。而轉(zhuǎn)移性和侵襲性是惡性腫瘤的重要特征［6］，腫瘤若失去轉(zhuǎn)移特性其惡性度將大大降低，對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究是攻克腫瘤不可缺少的重要基礎(chǔ)工作之一。利用涎腺腺樣囊性癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系(SACC-83)與高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系(SACC-LM)，對SACC的轉(zhuǎn)移機制進(jìn)行科學(xué)研究，探索核激素受體PPARγ與SACC轉(zhuǎn)移的關(guān)系，進(jìn)一步豐富對SACC轉(zhuǎn)移的研究。

1 Issemann I，Green S.Activation of a Member of the Steroid-Hormone Receptor Superfamily by Peroxisome Proliferators.Nature，1990，347:645-650.

2 Wang TT，Xu J，Yu XF，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma in malignant diseases.Critical Reviews in Oncology Hematology，2006，58:1-14.

3 Han S，Roman J.Peroxisome proliferator-activated receptorγ:a novel target for cancer therapeutics?Anti-Cancer Drugs，2007，18:237-244.

4 Sung MW，Kim JW.Clinicopathologic predictorsand impact of distant metastasis from adenoid cystic cancinoma of the head and neck.Arch Otolarngol Head Neck Surg，2003，129:1193-1197.

5 Wei S，Yang J，Lee SL，et al.PPAR gamma-independent antitumor effects of thiazolidinediones.Cancer Letters，2009，276:119-124.

6 方偉崗.21世紀(jì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移研究面臨的機遇和挑戰(zhàn).中華醫(yī)學(xué)雜志，2001，81:193-194.