外生菌根菌對(duì)油松幼苗抗氧化酶活性及根系構(gòu)型的影響

祁金玉,鄧?yán)^峰,尹大川,蔡立新,劉冬萍,張麗麗,林 梅

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 沈陽(yáng) 110866

油松(Pinustabulaeformis)為中國(guó)特有樹(shù)種。它適應(yīng)性強(qiáng),根系發(fā)達(dá),耐干旱耐瘠薄,是我國(guó)北方地區(qū)最主要造林樹(shù)種[1],依賴菌根來(lái)吸收水分和養(yǎng)分以適應(yīng)不良的環(huán)境條件[2- 3]。外生菌根具有促進(jìn)油松生長(zhǎng),增強(qiáng)油松抗逆性的作用[4- 6]。

植物根系將植物固定在土壤中支撐著植物的地上部分,是植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官,根系的空間分布特征對(duì)其吸收水分養(yǎng)分的能力、根系生物量/根系生產(chǎn)力和根系動(dòng)態(tài)變化有重要影響[7-8]。外生菌根真菌(Ectomycorrhizal fungi；簡(jiǎn)稱ECMF)侵染植株根系后,增加了植株根系的適應(yīng)性,拓寬了植株獲取營(yíng)養(yǎng)的渠道。吳小芹等[9]研究接種黃色須腹菌(Rhizopogenluteous)、彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius)和美味牛肝菌(Boletusedulis)均能增加黑松(P.thunbergii)根系直徑、吸收根的分布范圍等根系參數(shù)。翟帥帥等[10]研究褐環(huán)乳牛肝菌(S.luteus)接種馬尾松顯著增加了馬尾松根系總長(zhǎng)度、表面積、體積等根系參數(shù),擴(kuò)展了根系分布范圍。目前對(duì)油松根系的研究,主要有不同光照、施用有機(jī)碳肥等條件下油松根系變化情況,以及建立油松根系的三維靜態(tài)模型[11- 13]。對(duì)于不同種類的外生菌根真菌接種后油松幼苗根系構(gòu)型報(bào)道較少。

本研究通過(guò)對(duì)油松接種褐環(huán)乳牛肝菌(S.luteus)和紅汁乳菇(L.hatsudake),以期促進(jìn)油松幼苗苗高地徑的增長(zhǎng),提高苗木理化性質(zhì),探討兩種ECMF對(duì)油松根系構(gòu)型的促生效應(yīng),為培育優(yōu)良的油松菌根苗木,提高造林成活率,提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油松種子由撫順林業(yè)局提供。供試菌種：紅汁乳菇(L.hatsudake)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)；褐環(huán)乳牛肝菌(S.luteus)分離自遼寧省彰武縣章古臺(tái)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)準(zhǔn)備

種子催芽：2016年4月20日播種,選取大小一致的油松種子,預(yù)先用0.5%高錳酸鉀消毒30 min,無(wú)菌水沖洗數(shù)次后,用滅菌濕紗布包裹保濕,置于25℃人工氣候箱中催芽,每天早、晚用無(wú)菌水各沖洗1次,直至出芽。

無(wú)菌土制備：試驗(yàn)用盆為營(yíng)養(yǎng)缽(15 cm×12 cm×13 cm)。缽內(nèi)預(yù)先裝入121℃下高溫高壓滅菌2 h的混合土(草炭土∶蛭石∶河沙=2∶1∶1),每盆土量重約500 g。

菌劑制備：用直徑5 mm的無(wú)菌打孔器,切取在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的褐環(huán)乳牛肝菌、紅汁乳菇,分別接種于盛有250 mL PD液體培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20 g,馬鈴薯200 g,KH2PO43 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,H2O 1000 mL)的三角瓶中,每瓶接種3片菌餅。置于搖床上(25℃、160 r/min)振蕩培養(yǎng),得到液體菌劑。使用前按照菌劑和水體積為1∶3的比例混合,用攪碎機(jī)將菌絲體攪碎做勻漿處理,備用。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置3種處理方式：

處理1：接種無(wú)菌PD培養(yǎng)基(CK)；

處理2：接種紅汁乳菇(LH)；

處理3：接種褐環(huán)乳牛肝菌(SL)。

待幼苗成活定株后,采取打孔灌根接種的方式接種紅汁乳菇和褐環(huán)乳牛肝菌,每盆接種50 mL菌劑。CK施以等量無(wú)菌PD培養(yǎng)基。每個(gè)處理10次重復(fù),每盆5株苗,共30盆,150株苗。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1菌根侵染率

在苗木生長(zhǎng)4個(gè)月后,每處理隨機(jī)挖取油松幼苗10株,在體式鏡下觀察菌根形態(tài),測(cè)定菌根侵染率。

外生菌根侵染率采用統(tǒng)計(jì)計(jì)算法。將根樣剪成1 cm等長(zhǎng)的根段,隨機(jī)選取根樣,每樣100個(gè)根段,在體視鏡下觀察外生菌根侵染率。

1.4.2苗木生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

每處理隨機(jī)取樣10株,輕輕抖掉表面土,流水沖掉根部附著土,用卷尺和游標(biāo)卡尺分別測(cè)量植株的苗高、地徑；用吸水紙吸干水分電子天平稱取鮮重,80℃烘干至恒重稱取干重。

1.4.3苗木抗氧化酶活性

分別選取不同處理油松苗相同部位針葉和根系取樣,利用南京建成試劑盒測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性。

1.4.4苗木根系參數(shù)測(cè)定

根系生長(zhǎng)：掃描儀對(duì)不同處理的根系進(jìn)行掃描、分級(jí)。用萬(wàn)深LA-S植物根系分析系統(tǒng)對(duì)根系長(zhǎng)度、投影面積、表面積、體積、平均直徑、根尖數(shù)、分枝數(shù)、交叉數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行分析。

根系空間構(gòu)型：測(cè)定一級(jí)側(cè)根與主根的夾角,根據(jù)吳小芹[11]方法將一級(jí)側(cè)根分為3類(Ⅰ：<60°側(cè)根；Ⅱ：60°—80°側(cè)根；Ⅲ：80°—90°側(cè)根),計(jì)算各類角度側(cè)根占一級(jí)側(cè)根總數(shù)的比例。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)用SPSS進(jìn)行單因素差異顯著性分析,α=0.05,并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 油松幼苗的菌根侵染率及形態(tài)觀察

油松幼苗菌根侵染率見(jiàn)表1,菌根形態(tài)見(jiàn)圖1。由表1可知,兩種外生菌根菌均能與油松形成外生菌根,其中褐環(huán)乳牛肝菌與油松菌根合成率最高為68.62%,紅汁乳菇與油松菌根合成率為62.12%,二者差異不顯著。

褐環(huán)乳牛肝菌與油松可形成棒狀和二叉狀分支的菌根；紅汁乳菇與油松形成的菌根中只觀察到棒狀菌根。形成菌根的苗木根系前端有膨大增粗,呈盾圓形。對(duì)照未形成菌根根系前端平齊。

圖1 形成菌根形態(tài)(20×)Fig.1 The formation of mycorrhizal synthesis(20×)CK：對(duì)照Control check；LH：紅汁乳菇Lactarius hatsudake；SL：褐環(huán)乳牛肝菌Suillus luteus

2.2 不同外生菌根菌對(duì)油松幼苗生長(zhǎng)的影響

對(duì)照油松生長(zhǎng)纖細(xì),針葉稀疏,接種紅汁乳菇和褐環(huán)乳牛肝菌處理油松幼苗生長(zhǎng)健壯,針葉較對(duì)照茂密,其中接種褐環(huán)乳牛肝菌油松針葉尤其茂盛。

接種處理均能顯著提高油松的苗高、地徑；地上和地下部分的鮮重、干重。不同接種處理只有地徑差異不顯著(P>0.05),接種褐環(huán)乳牛肝菌相比接種紅汁乳菇的苗木苗高增加12.17%；地上和地下部分的鮮重增加37.68%、60.68%;地上和地下部分的干重增加40.11% 、61.64%。

表1 不同處理對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響

CK：對(duì)照Control check；LH：紅汁乳菇Lactariushatsudake；SL：褐環(huán)乳牛肝菌Suillusluteus

2.3 不同外生菌根菌對(duì)油松幼苗抗氧化酶活性的影響

不同處理油松幼苗抗氧化酶活性見(jiàn)表2。接種外生菌根菌的油松幼苗針葉和根系SOD、POD、CAT 3種抗氧化酶活性均大于不接種處理,經(jīng)方差分析接種處理與對(duì)照CK存在顯著差異。接種褐環(huán)乳牛肝菌幼苗針葉的抗氧化酶活性均大于接種紅汁乳菇幼苗,其中SOD活性比接種紅汁乳菇的高14.77%,POD活性高20.77%,CAT活性高34.68%；根系中抗氧化酶活性也均大于接種紅汁乳菇幼苗,分別高出8.54%,4.34%,33.31%。

表2 不同處理對(duì)幼苗針葉和根系抗氧化酶活性的影響/(U g-1s-1)

2.4 不同外生菌根菌對(duì)油松幼苗根系構(gòu)型的影響

2.4.1根系參數(shù)

不同處理根系生長(zhǎng)參數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。接種處理顯著提高了油松根系長(zhǎng)度、表面積、體積、平均直徑、根尖數(shù)、分叉數(shù)。接種褐環(huán)乳牛肝菌和紅汁乳菇處理與對(duì)照相比,根系長(zhǎng)度分別增加12.82%和19.15%；表面積分別增加70.37%、69.81%；根系體積分別增加92.34%、92.61%；根系平均直徑均增加66.67%；根尖數(shù)分別增加92.24%、88.13%；分叉數(shù)分別增加79.29%、80.41%。

表3 不同處理幼苗根系生長(zhǎng)參數(shù)

2種接種處理根系參數(shù)中根系長(zhǎng)度增加幅度較小,在10.00%—20.00%之間；其余指標(biāo)均增加60.00%以上。方差分析表明接種處理與對(duì)照均存在顯著差異,兩種接種處理間只有根尖數(shù)存在顯著差異,其他根系參數(shù)指標(biāo)均差異不顯著。

2.4.2油松不同菌根幼苗根系空間構(gòu)型

不同處理油松幼苗的根系分布情況見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 不同處理油松根系形態(tài)Fig.2 Pinus tabulaeformisroot morphology under different treatments

圖3 油松不同外生菌根苗木根系不同角度一級(jí)側(cè)根所占比例 Fig.3 The occupation of primary lateral roots in the different angle of branch under different the mycorrhizal inoculation

由圖2可見(jiàn)接種褐環(huán)乳牛肝菌的油松根系構(gòu)型明顯優(yōu)于接種紅汁乳菇和對(duì)照。由圖3可見(jiàn)接種褐環(huán)乳牛肝菌幼苗根沿主根分支成80°—90°的一級(jí)側(cè)根占23.81%,60°—80°的一級(jí)側(cè)根占16.65%,<60°的一級(jí)側(cè)根占59.54%；接種紅汁乳菇幼苗根沿主根分支成80°—90°的一級(jí)側(cè)根占13.3%,60°—80°的一級(jí)側(cè)根占17.34%,<60°的一級(jí)側(cè)根占69.36%；對(duì)照幼苗根沿主根分支成80°—90°的一級(jí)側(cè)根僅占2.41%,60°—80°的一級(jí)側(cè)根占4.91%,<60°的一級(jí)側(cè)根占92.68%。其中褐環(huán)乳牛肝菌80°—90°的一級(jí)側(cè)根最多,紅汁乳菇次之,對(duì)照根系中所占比例最少,因而接種褐環(huán)乳牛肝菌幼苗的根系沿根圍不同方向生長(zhǎng)范圍最廣,對(duì)照根系中80°—90°的一級(jí)側(cè)根少,限制了根系的橫向生長(zhǎng)。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)室條件下選用的兩種外生菌根菌均能與油松合成典型的外生菌根,菌根侵染率超過(guò)60%。低于劉強(qiáng)[14]褐環(huán)乳牛肝菌與油松的菌根合成率和翟帥帥等[10]褐環(huán)乳牛肝菌與馬尾松菌根合成率,這可能是因?yàn)椴煌杉攸c(diǎn)菌株差異、不同寄主植物間差異或菌劑施用濃度的差異。褐環(huán)乳牛肝菌與油松主要形成棒狀和二叉狀菌根；紅汁乳菇與油松主要形成棒狀菌根,試驗(yàn)中未觀察到其他形態(tài)菌根。研究結(jié)果同時(shí)表明,兩種外生菌根接種處理均顯著提高了油松幼苗的苗高、地徑、干重、鮮重。

CAT、POD 和 SOD 是植物體內(nèi)主要的抗氧化酶系,通過(guò)它們的變化程度可以反映植物的抗逆性[15]。SOD作為植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線在生物體中普遍存在,它將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫,控制細(xì)胞膜脂過(guò)氧化,接著由 CAT 和 POD 立即將過(guò)氧化氫分解為無(wú)害的水[16- 17]。在正常的條件下,植物體內(nèi)酶彼此協(xié)調(diào),防御系統(tǒng)中酶的活性高低就成為控制傷害的決定因素,也能較好地反映植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力[18]。本研究中接種外生菌根油松幼苗的針葉和根系3種抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性顯著高于不接種處理,兩種外生菌根菌處理間褐環(huán)乳牛肝菌針葉和根系抗氧化酶活性均高于紅汁乳菇處理,其中只有根系POD活性間無(wú)顯著差異,其余均具有顯著差異。

生長(zhǎng)指標(biāo)可以直接評(píng)價(jià)苗木生長(zhǎng)的好壞程度。油松接種兩種外生菌根菌后,苗高、地徑等生長(zhǎng)指標(biāo)有了顯著提高,說(shuō)明選用的兩種外生菌根菌均具有促進(jìn)苗木生長(zhǎng)的作用。褐環(huán)乳牛肝菌與松科合成菌根的研究較多,紅汁乳菇研究報(bào)道較少,周崇蓮等[19]報(bào)道了紅汁乳菇與馬尾松形成菌根促進(jìn)生長(zhǎng)；薛振文等[20]研究了與馬尾松接種適宜的紅汁乳菇菌劑量；李小利[21]研究了紅汁乳菇與黑松能形成菌根,其他大多是野外調(diào)查紅汁乳菇與松科植物的菌根情況[22]。本研究證明紅汁乳菇也能在人工條件下與油松形成菌根,并促進(jìn)油松生長(zhǎng)。但研究結(jié)果表明接種褐環(huán)乳牛肝菌對(duì)油松幼苗生長(zhǎng)及生物量的積累作用優(yōu)于紅汁乳菇,同時(shí),接種褐環(huán)乳牛肝菌的油松苗木針葉和根系中保護(hù)酶活性均高于紅汁乳菇接種苗木。生長(zhǎng)健壯的苗木,其體內(nèi)抗氧化酶系也相應(yīng)的高,進(jìn)一步從生理角度證明適宜接種褐環(huán)乳牛肝菌培育油松壯苗。

根系長(zhǎng)度、表面積和體積是衡量植物根系分布范圍的重要參數(shù),接種紅汁乳菇和褐環(huán)乳牛肝菌增加了油松根系總長(zhǎng)度、表面積和體積。平均根系直徑、根尖數(shù)、分叉數(shù)是衡量根系吸收功效的重要參數(shù),接種紅汁乳菇和褐環(huán)乳牛肝菌增加了油松根系平均直徑、根尖數(shù)、分叉數(shù)。這與翟帥帥等[10]在褐環(huán)乳牛肝菌對(duì)馬尾松根系構(gòu)型的促進(jìn)作用的研究結(jié)果一致。

不同處理油松幼苗的根系各不同角度的根分布不均衡,其中接種褐環(huán)乳牛肝菌幼苗根沿主根分支成80°—90°的一級(jí)側(cè)根占23.81%,顯著大于紅汁乳菇接種處理,<60°的一級(jí)側(cè)根顯著低于紅汁乳菇處理。結(jié)合根系生長(zhǎng)參數(shù)、一級(jí)側(cè)根角度綜合看,雖然在根系總長(zhǎng)度、表面積等參數(shù)上紅汁乳菇和褐環(huán)乳牛肝菌作用基本相同,但接種褐環(huán)乳牛肝菌油松幼苗一級(jí)側(cè)根角度中80°—90°的一級(jí)側(cè)根最多,有利于根系擴(kuò)大沿根圍向不同方向生長(zhǎng)的范圍,表明褐環(huán)乳牛肝菌形成的油松根系發(fā)達(dá)、分布范圍廣,更利于養(yǎng)分和水分的吸收。所以接種褐環(huán)乳牛肝菌的處理方式更有利于油松生長(zhǎng)。對(duì)照根系中80°—90°的一級(jí)側(cè)根很少,限制了根系的橫向生長(zhǎng)。一旦外生菌根菌與樹(shù)木根形成外生菌根后,特殊結(jié)構(gòu)和根-菌互作,使外生菌根具有諸多功能。有些地區(qū)缺乏外生菌根菌,在常規(guī)造林的過(guò)程中使其自然感染菌根真菌是相當(dāng)難的,為了達(dá)到更高的油松造林成活率,人為菌根化苗木的培育就顯得十分重要。

由于研究條件等的限制,相比較地上部分功能形狀的研究,根系研究仍相對(duì)滯后[23]。本研究中選用傳統(tǒng)方法中的容器法,由于受容器限制,會(huì)抑制或影響根系生長(zhǎng),從而致使觀測(cè)數(shù)據(jù)與實(shí)際情況的不符,還需要今后利用苗圃等野外實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。