單基因遺傳病與拷貝數(shù)變異的研究進展

李世音，周 浩，秦海濤(綜述)，郭 洪，白 云(審校)

(第三軍醫(yī)大學 1學員旅十五隊， 2醫(yī)學遺傳學教研室，重慶 400038)

拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)一般是指長度>1 kb的基因組大片段拷貝數(shù)增加或者減少，主要表現(xiàn)為亞顯微水平的缺失、重復或倒位。與基因多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)相比，CNV數(shù)量雖然不多，但涉及的基因組序列更多，突變率更高。CNV是人類遺傳多樣性與個體間遺傳差異的一個重要原因，除了構(gòu)成遺傳多態(tài)性外，部分還與疾病相關(guān)。2004年，兩項具有里程碑式的研究發(fā)現(xiàn)這種DNA拷貝數(shù)亞微觀的變異廣泛存在于正常人類基因組中[1-2]。Redon等[3]和Wong等[4]相繼發(fā)布了人類基因組的CNV圖譜。2011年，Mills等[5]指出人類基因組中每400萬個堿基對中平均有超過1000個CNV。CNV是基因組結(jié)構(gòu)變異的重要組成部分。近年來，CNV在遺傳病中的作用越來越受到重視，除了與多基因疾病有關(guān)外，單基因病相關(guān)CNV的遺傳效應也更加顯著。CNV的致病機制可能與基因的劑量效應、基因斷裂、基因融合以及位置效應等有關(guān)。

1 CNV的突變機制與致病機制

1.1CNV的突變機制 CNV的形成機制主要分為DNA重組與DNA錯誤復制兩大類。DNA重組主要包括非等位同源重組和非同源末端連接[6]。非等位同源重組是不同基因組位置的兩條同源重復序列配對交換導致的，主要發(fā)生在減數(shù)分裂過程中，相同染色體上重復序列間的同源重組會導致重復、缺失或倒位，而不同染色體上重復序列間的同源重組則可能導致染色體易位。與非等位同源重組不同，非同源末端連接不需要同源DNA片段作為底物，并且可以在連接部位插入堿基。

隨著對CNV結(jié)構(gòu)的精細解析，一些復雜的CNV無法由DNA重組模型來解釋，Lee等[7]提出并證實了“復制叉停滯與模板交換”模型的存在，該模型發(fā)生在DNA復制叉停滯時，滯后鏈從一個復制叉上脫落，通過微同源序列轉(zhuǎn)到另一個空間位置上接近的復制叉。根據(jù)復制叉的方向和位置，該模型可以導致正向或反向的缺失或重復，產(chǎn)生的CNV也可大可小。

1.2CNV的致病機制 染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目畸變會導致染色體病的發(fā)生，而亞顯微水平的CNV也與人類疾病密切相關(guān)[8]。CNV參與疾病的發(fā)病機制主要與相關(guān)基因的表達劑量相關(guān)，如一些劑量敏感基因的整個基因缺失或重復會導致疾病的發(fā)生。此外，如果缺失或插入發(fā)生在基因的編碼區(qū)，則會導致基因斷裂或融合，使蛋白產(chǎn)物丟失或改變。位于基因內(nèi)非編碼區(qū)、基因間區(qū)甚至基因荒漠區(qū)的CNV，則可能是通過位置效應影響基因的表達量而參與疾病的發(fā)生，如啟動子區(qū)、非翻譯區(qū)、增強子區(qū)或者隔離子區(qū)等。

2 CNV的檢測方法

2.1全基因組范圍的CNV研究方法 CNV作為一種直接或間接參與疾病發(fā)生、發(fā)展的新型基因組結(jié)構(gòu)變異形式，如何對其進行快速、準確的檢測非常重要。目前，用來進行全基因組范圍CNV研究的方法有比較基因組雜交芯片技術(shù)(array-based comparative genomichybridization，aCGH)、單核苷酸多態(tài)性分型芯片技術(shù)(SNP array)和新一代測序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)[9]。

aCGH技術(shù)是在一張芯片上用標記不同熒光的樣品(病例樣品和對照樣品)進行共雜交，檢測病例樣本基因組相對于對照基因組的DNA拷貝數(shù)變化(CNV)，常用于腫瘤或遺傳性疾病全基因組的CNV檢測，可直觀地表現(xiàn)出腫瘤及遺傳性疾病基因組DNA在整個染色體組的缺失或擴增。

SNP array技術(shù)也是基于芯片雜交的方法，但與aCGH不同的是SNP芯片是單通道的，即一個點陣只雜交一個樣本。此外，SNP芯片中的探針是專門針對單核苷酸差異設計的，因此每條探針都能得到較好的信噪比。SNP等位基因特異的探針設計提高了CNV檢測靈敏度，可以鑒定中性拷貝數(shù)的雜合缺失、單親二體及嵌合現(xiàn)象。早期的SNP芯片CNV探針密度非常低，但近來廣泛應用的芯片(Affymetrix 6.0、cytoScan HD和Illumina 1M)中的探針更優(yōu)化，針對CNV的探針也更多。因此，SNP芯片可以作為aCGH芯片的一個重要補充手段，也可以用來大規(guī)模發(fā)掘人類基因組中的CNV。

NGS技術(shù)是DNA測序技術(shù)的一次革命，它一次可以同時對幾十萬至幾百萬條DNA進行測序，故亦稱為高通量測序技術(shù)。借助NGS數(shù)據(jù)也可以對CNV進行發(fā)掘、鑒定和精確定位，但需要大量的生物信息學分析，如末端配對作圖、分解比對作圖、序列組裝及基于測序深度檢測的分析方法[10-11]。雖然基于NGS方法的成本和可靠性等問題還未解決，但是該策略是今后高通量CNV分析的重要發(fā)展方向。

2.2候選CNV研究方法 全基因組CNV分析技術(shù)成本較高，無法檢測到平衡結(jié)構(gòu)變異，無法確定變異的具體位置，如果只對基因組中個別CNV進行研究，那么單分子候選CNV檢測就顯得非常合適，如熒光原位雜交、Southern blotting雜交、熒光實時定量聚合酶鏈反應、多重連接探針擴增以及多重基因拷貝數(shù)檢測技術(shù)等。

不管是全基因組還是候選的CNV研究技術(shù)，都有優(yōu)勢和局限性，僅使用一種方法還不能檢測出某一個體基因組所包含的全部CNV。目前為止，還未發(fā)現(xiàn)所有的人類基因組CNV，除了檢測技術(shù)需要進一步發(fā)展外，已有的人類基因組參考序列還需要完善。

3 CNV導致的單基因遺傳病

包括CNV在內(nèi)的大范圍的染色體結(jié)構(gòu)變異一直被認為與很多人類疾病有關(guān)，CNV主要通過基因劑量效應、基因斷裂、基因融合以及位置效應等方式參與疾病發(fā)生[12]?，F(xiàn)總結(jié)了目前已知的與CNV相關(guān)的單基因遺傳病(表1)，以下主要依據(jù)CNV的作用區(qū)域?qū)追N有代表性的單基因病進行介紹。

表1 CNV相關(guān)單基因遺傳病

3.1CNV位于外顯子編碼區(qū) 并趾-內(nèi)眥距增寬-肛門與生殖器異常-腎臟異常STAR綜合征(toe syndactyly,telecanthus,anogenital and renal malformations，STAR綜合征)是一類X染色體連鎖顯性遺傳病，主要表現(xiàn)為趾尖并指、內(nèi)眥距過寬、肛門生殖器及腎臟畸形。Unger等[13]通過aCGH、熒光實時定量聚合酶鏈反應以及測序發(fā)現(xiàn)，STAR綜合征的主要致病原因是Xq28上FAM58A基因內(nèi)的大片段缺失。FAM58A基因包含5個外顯子共642 bp的編碼區(qū)域，其可能參與細胞周期的調(diào)控。該基因的大片段缺失導致異常蛋白表達產(chǎn)物的出現(xiàn)，使細胞增殖受阻，從而出現(xiàn)相應的臨床表現(xiàn)。

3.2CNV位于上游調(diào)控元件

3.2.1并指伴顱縫早閉 IHH基因是hedgehog家族的分泌信號分子，調(diào)控軟骨細胞的分化、皮質(zhì)骨的形成以及關(guān)節(jié)發(fā)育。Klopocki等[14]在顱縫早閉伴并指家系中檢測到2q35區(qū)域IHH基因上游存在不同大小的重復，基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)，IHH基因上游有一個高度保守的非編碼元件，該元件的拷貝數(shù)增加導致了并指和顱縫早閉的發(fā)生，該元件位于鄰近基因非同源末端連接1的大段內(nèi)含子上，這與SHH基因的情形相似，SHH基因的增強子極化活性區(qū)調(diào)控序列(ZRS)也位于一個側(cè)翼基因LMBR1的內(nèi)含子上，說明這類基因可能有相同的進化歷史，遠距離調(diào)控元件在進化與發(fā)育過程中有重要作用。

3.2.2眼裂狹小綜合征 眼裂狹小綜合征主要表現(xiàn)為特征性的后仰性頭部傾斜、眼裂狹小、鼻梁扁平、子宮卵巢萎縮以及眉弓隆起。D′haene等[15]在57例FOXL2基因編碼區(qū)無突變的眼裂狹小綜合征患者中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2基因上游283 kb處出現(xiàn)了一段長度為7.4 kb的缺失，并證實該缺失是由H-DNA介導的雙鏈斷裂所引起的。熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，該缺失區(qū)域?qū)OXL2基因的表達存在調(diào)控作用，并通過染色體構(gòu)象捕獲實驗(chromosome conformation capture assay，3C實驗)發(fā)現(xiàn)該區(qū)域與FOXL2基因啟動子之間存在相互作用[15]。

3.2.3A2型短指 A2型短指臨床表現(xiàn)為第二指和第五指中指骨畸形，主要由BMPR1B或GDF5的基因突變引起。Dathe等[16]通過連鎖分析在一個A2型短指家系中定位了一個新的染色體位置20p12.3，并在BMP2基因下游110 kb處發(fā)現(xiàn)了一個5.5 kb高度保守的重復區(qū)域。進一步通過轉(zhuǎn)基因小鼠模型發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域可促進肢端X-Gal報告基因的表達。

3.3CNV位于遠距離增強子

3.3.1三節(jié)拇指-并指多指綜合征和4型并指 2型軸前多指的基因突變定位于7q36區(qū)域的ZRS，Lettice等[44]發(fā)現(xiàn)ZRS序列的點突變是2型軸前多指的致病原因。三節(jié)拇指-并指多指綜合征(triphalangeal thumb-polysyndactyly syndrome，TPT-PS)和4型并指(syndactyly type 4，SD4)也定位于7q36區(qū)域。2008年，Klopocki等[17]在一個TPT-PS大家系中通過aCGH發(fā)現(xiàn)患者的極化活性區(qū)調(diào)控序列(ZPA regulatory sequence，ZRS)存在拷貝數(shù)重復。Sun等[18]在3個TPT-PS家系、2個伴SD4的TPT-PS家系以及1個SD4家系中同樣發(fā)現(xiàn)患者ZRS區(qū)均存在拷貝數(shù)重復。

3.3.2腭裂與短指無甲綜合征 Pierre Robin綜合征是腭裂的一種，Benko等[19]發(fā)現(xiàn)17q24區(qū)域SOX9基因附近的微缺失與Pierre Robin綜合征有關(guān)，并在體外和體內(nèi)證實該缺失區(qū)域存在增強子活性，在小鼠模型中還發(fā)現(xiàn)該增強子調(diào)控SOX9的表達，因此推測Pierre Robin綜合征的致病原因可能與該增強子的缺失引起SOX9基因的表達失控有關(guān)。隨后Kurth等[20]通過aCGH在4個短指無甲綜合征家系中同樣發(fā)現(xiàn)，患者17q24.3區(qū)域均存在微重復，4個家系的最小重疊區(qū)大約為1.2 Mb，包括KCNJ2基因與SOX9基因之間的基因荒漠區(qū)，認為該區(qū)域中SOX9增強子元件的重復導致的SOX9基因時空表達紊亂可能是該病的致病原因。

3.4CNV作用于基因區(qū)域未知的單基因疾病

3.4.1先天性全身多毛癥 先天性全身多毛癥是一種以全身終毛過度生長、增長為表現(xiàn)的罕見單基因病。研究者首先在3個大家系中進行全基因組連鎖分析，將致病基因定位到17q24.2～q24.3，通過基因芯片發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域所有患者都存在微缺失，并在1例散發(fā)患者中，在該區(qū)域又發(fā)現(xiàn)了一個反向微重復，因此認為先天性全身多毛癥是一種基因組疾病[21]。3個家系及散發(fā)患者CNV的最小重疊區(qū)包括4個基因，ABCA5、ABCA6、ABCA10和MAP2K6，中國漢族正常人群中存在包含這3個ABCA基因的203 kb大小的拷貝數(shù)缺失多態(tài)性，因此推測MAP2K6基因可能是先天性全身多毛癥的候選致病基因，但17q24.2～q24.3區(qū)域CNV具體的生物學意義與機制仍需要進一步研究[21]。

3.4.2面肩肱型肌營養(yǎng)不良1型 面肩肱型肌營養(yǎng)不良1型是一種比較常見的遺傳性肌營養(yǎng)不良，僅次于杜氏營養(yǎng)不良，大部分患者的病情進展緩慢，其特征性表現(xiàn)出現(xiàn)在20歲左右，表現(xiàn)為兩側(cè)面部和肩胛肌肉的顯著不對稱。1993年，Weiffenbach等[45]通過連鎖分析將該病的致病基因定位到4q35區(qū)域，該區(qū)域位于近端粒的位置，是一個基因荒漠區(qū)，主要由3.3 kb大小的多態(tài)性重復序列D4Z4構(gòu)成，正常人D4Z4的重復次數(shù)介于11～150，如果重復次數(shù)減少到10個以下，則會導致面肩肱型肌營養(yǎng)不良1型的發(fā)生[22]。然而時至今日，其致病基因及變異仍未發(fā)現(xiàn)。

4 結(jié) 語

人類基因組變異主要包含SNP、插入與缺失以及CNV等，其中CNV是人群個體間遺傳差異的主要來源。CNV除了導致罕見的單基因疾病外，也與人類復雜疾病相關(guān)。目前，復雜疾病遺傳學研究的瓶頸在于全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)的陽性SNP位點的生物學功能難以注釋，而且這些SNP位點構(gòu)成的遺傳效應仍然非常微小。由于CNV可能直接參與疾病的發(fā)生，其遺傳效應更大，因此CNV的研究可能有助于對復雜疾病遺傳機制的揭示。此外，單基因遺傳病家系中致病性CNV的研究可能也有助于對復雜疾病遺傳機制的理解，有助于更好地認識基因組變異與疾病間的關(guān)系。隨著CNV研究方法的進展，CNV的密度和精細程度會提升，對CNV相關(guān)疾病的深入研究將對CNV的發(fā)生、效應及其對選擇與進化的作用產(chǎn)生新的認識。

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