Nec-1對岡田酸誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元損傷的保護作用

李艷麗，王增仙，武敏霞

生理條件下，蛋白磷酸酶2A（PP2A）與蛋白激酶調(diào)節(jié)微管相關(guān)蛋白tau蛋白磷酸化水平，處于低水平磷酸化的動態(tài)平衡［1］。岡田酸（okadaic acid，OA）是一種蛋白磷酸酯酶抑制劑，對PP2A有特異性抑制作用［2］。OA能使神經(jīng)元tau蛋白異常過度磷酸化，繼而引起神經(jīng)元毒性［3］。

Degterev等［4］研究發(fā)現(xiàn)，在細胞內(nèi)不存在凋亡信號時，F(xiàn)as／TNFR能活化一種非凋亡的死亡途徑，稱為壞死性凋亡（necroptosis）。同時，他們發(fā)現(xiàn)一種小分子物質(zhì)necrostatin-1（Nec-1）可以特異且有效地抑制壞死性凋亡。本研究旨在探討Nec-1對OA誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷是否有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試 劑 DMEM／F-12 和 胎 牛 血 清 （Gibco-BRL）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）、calcein-AM（Dojindo）；OA、阿糖胞苷、多聚賴氨酸、Nec-1（Sigma）；胰蛋白酶（Biosharp）；乳酸脫氫酶（LDH）（南京建成生物工程研究所）。

1.2 原代細胞培養(yǎng) 取新生1 d～3 d Wistar大鼠，分離大腦皮層，用胰酶消化制備單細胞懸液。細胞懸液經(jīng)1 000 r／min離心5 min，棄上清，用完全培養(yǎng)液（DMEM／F-12培養(yǎng)基＋15%胎牛血清）重懸細胞。然后接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板上，在37℃，5%CO2的孵育箱培養(yǎng)。24 h后加入10μmol／L阿糖胞苷。成熟的神經(jīng)元（8 d～10 d）用于實驗。

1.3 實驗分組 將 Wistar大鼠分為5組，對照組、OA組（10 nmol／L）、Nec-1組在加入OA前24 h加入不同濃度的Nec-1（10μmol／L，30μmol／L，100μmol／L）預(yù)孵育。

1.4 細胞活力檢測 細胞在96孔板培養(yǎng)（100μL／孔），向各孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃，5%CO2的孵育箱孵育2 h，用酶標儀測定490 nm處OD值。

1.5 LDH的檢測 當細胞遭受損傷時，LDH由胞漿釋放到胞外。加入OA 24 h后，收集培養(yǎng)液檢測LDH活性。

1.6 calcein-AM染色 細胞與calcein-AM避光孵育20 min，PBS避光洗滌兩次，在490 nm激發(fā)波長，515 nm發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡下觀察細胞。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Nec-1抑制OA引起的細胞活力的下降 CCK-8細胞活力檢測發(fā)現(xiàn)OA引起皮層神經(jīng)元損傷。與對照組相比，將神經(jīng)元暴露于OA 2 h，細胞活力降至（52.55±2.86）%（P＜0.01）。在OA作用前24 h用Nec-1預(yù)處理神經(jīng)元可以抑制OA引起的細胞活力的下降。Nec-1（30μmol／L）和 Nec-1（100μmol／L）分別使其增加10%（P＜0.05）和19%（P ＜0.01），但 Nec-1（10μmol／L）并不能抑制OA引起的細胞活力的降低。詳見圖1。

圖1 Nec-1抑制OA引起的細胞死亡

2.2 Nec-1抑制OA引起的LDH釋放的增加 皮層神經(jīng)元暴露于OA可引起LDH的釋放。OA處理后，LDH水平與對照組相比增加44.36%（P＜0.01）。Nec-1（30μmol／L）和 Nec-1（100 μmol／L）預(yù)處理分別使LDH釋放減少13%（P＜0.05）和21%（P＜0.01）。詳見圖2。

圖2 Nec-1抑制OA引起的LDH釋放

2.3 Nec-1抑制OA引起的活細胞數(shù)的減少 Calcein-AM染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)OA可引起活細胞數(shù)減少。OA處理后，Calcein-AM染色陽性的神經(jīng)元（代表活細胞）與對照組相比減少45.16%（P＜0.05）。與 OA處理組相比，Nec-1（30μmol／L）和Nec-1（100μmol／L）分別使活細胞數(shù)增加11%（P＜0.05）和20%（P＜0.01）。

3 討 論

阿爾茲海默?。ˋD）是引起老年期癡呆最常見的原因。隨著我國人口結(jié)構(gòu)的逐步老齡化，該病的高發(fā)病率和危害性也越來越被關(guān)注。其主要的病理特征是腦內(nèi)出現(xiàn)老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFT）［5］。過度磷酸化的tau蛋白是形成神經(jīng)纖維纏結(jié)的主要成分，在AD發(fā)病中發(fā)揮重要作用［6］。

PP2A是腦內(nèi)調(diào)節(jié)tau蛋白去磷酸化的主要磷酸酶［7］。研究報道，AD病人腦中PP2A活性降低30%左右。PP2A活性降低是導(dǎo)致AD病人tau蛋白過度磷酸化的主要原因［8］。OA是一種特異性的PP2A抑制劑，在體內(nèi)或體外條件下，OA可使神經(jīng)細胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白tau過度磷酸化，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞退化［9］。

壞死性凋亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種細胞死亡方式，Nec-1為其特異且有效的抑制劑，有可能成為臨床治療疾病的一個新靶點［4］。研究發(fā)現(xiàn)Nec-1可抑制中風(fēng)模型或創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）模型中的腦損傷［10，11］。前期研究也發(fā)現(xiàn)Nec-1抑制NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒作用［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)Nec-1可以抑制OA誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元損傷。已證實Nec-1抑制OA引起的細胞活力的降低、LDH釋放和活細胞數(shù)的減少。這些結(jié)果均表明Nec-1對OA誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元損傷有保護作用。Nec-1為壞死性凋亡的特異性抑制劑，證明在OA誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化引起的神經(jīng)元損傷中，壞死性凋亡起著重要作用，可以為AD疾病的治療提供新的靶點。

Tau蛋白過度磷酸化使tau蛋白結(jié)合微管能力降低［13］，神經(jīng)元軸突轉(zhuǎn)運障礙［14］，導(dǎo)致神經(jīng)元呈慢性進行性變性。本研究表明在神經(jīng)元變性過程中有壞死性凋亡的參與。盡管其作用可能只占其中一部分，但壞死性凋亡級聯(lián)反應(yīng)是可調(diào)節(jié)的，所以它可能會為AD的治療提供一個新的甚至更有效的靶點。

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