細(xì)胞色素P4502C19基因多態(tài)性檢測與氯吡格雷臨床應(yīng)用的相關(guān)性研究

曹艮元，閆國強(qiáng)

氯吡格雷（商品名波利維）一種臨床常用的血小板聚集抑制劑，通過與血小板膜表面二磷酸腺苷（ADP）受體選擇性的不可逆結(jié)合，繼而抑制ADP介導(dǎo)的通路活化而發(fā)揮作用。氯吡格雷為藥物前體，本身無活性，需被細(xì)胞色素P450（CYP）酶系轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)（clopidogrel）方可發(fā)揮作用，其中細(xì)胞色素P450 2C19（CYP2C19）的作用最重要［1］。CYP2C19酶由490個(gè)氨基酸組成，該酶在多種組織器官中均有分布，肝臟為主，參與多種藥物的體內(nèi)代謝［2］。CYP2C19基因多態(tài)性對(duì)CYP2C19酶活性起著決定性作用，基因多態(tài)性可影響對(duì)氯吡格雷活性的轉(zhuǎn)化能力，從而對(duì)臨床治療效果產(chǎn)生影響，表現(xiàn)為藥物療效的個(gè)體差異［3］。研究表明，CYP2C19＊1（野生型）、CYP2C19＊2（無功能突變型）、CYP2C19＊3（無功能突變型）為亞洲人群常見等位基因類型［4，5］。本研究目的是建立CYP2C19基因多態(tài)性的檢測方法（ARMS PCR），并且以 ADP誘導(dǎo)血小板聚集率分析CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷療效的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 我院2011年—2012年體檢健康人群，無藥物過敏史，檢測CYP2C19基因型，選擇CYP2C19＊1／＊1野生型10例，CYP2C19＊2／＊2 or＊3突變型純合子10例，CYP2C19＊1／＊2 or＊3突變型雜合子10例。其中男18名，年齡21歲～34歲（28歲±4歲），女12名，年齡20歲～35歲（29歲±5歲）。研究對(duì)象受試前2周及受試期間禁煙、酒，并且不服用任何藥物。

1.2 基因分型 利用ARMS PCR技術(shù)建立CYP2C19基因多態(tài)性檢測方法，設(shè)計(jì)特異性引物和探針序列，引物和探針委托生工生物工程（上海）有限公司合成及純化。樣本處理：抽取受試者靜脈血3 m L，EDTA抗凝，利用基因組提取試劑盒純化核酸，基因組提取試劑盒購自北京天根生化公司，按照其說明書操作。Taq酶擴(kuò)增系統(tǒng)購自上海Promega公司。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃預(yù)變性15 s，60℃退火、延伸、信號(hào)采集40 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)儀器：Mx3000熒光定量PCR儀，購自美國Agilent公司。基因分型結(jié)果由基因測序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率分析 受試者在第1天（300 mg）、第2天（75 mg）、第3天（75 mg）早飯前空腹服用氯吡格雷，并分別于首次服藥前和服藥后4 h采集靜脈血3 m L，枸櫞酸鈉抗凝。氯吡格雷購自法國賽諾菲-圣德拉堡制藥公司。采血后隨即進(jìn)行血小板聚集率分析。ADP購自美國Sigma公司，反應(yīng)濃度為5μmol／L，MPG-3型多功能血液凝聚儀購自上海斯隆醫(yī)電公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，同一基因型服藥前后血小板聚集率比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，不同基因型之間血小板聚集率比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因分型 采取受試者全血樣本進(jìn)行CYP2C19基因多態(tài)性分型，選擇CYP2C19＊1／＊1野生型10例，CYP2C19＊2／＊2 or＊3突變型純合子10例，CYP2C19＊1／＊2 or＊3突變型雜合子10例進(jìn)行血小板聚集率分析研究。分型結(jié)果利用基因測序確認(rèn)，二者一致。

2.2 ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率分析 通過對(duì)受試者服藥前后ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率進(jìn)行分析，3組CYP2C19基因型個(gè)體服藥前ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），服藥后3組個(gè)體均較服藥前明顯降低（P＜0.01），其中CYP2C19＊1／＊1野生型組服藥后聚集率明顯低于CYP2C19＊1／＊2 or＊3突變型雜合子和CYP2C19＊2／＊2 or＊3突變型純合子（P＜0.05），CYP2C19＊1／＊2 or＊3突變型雜合子與CYP2C19＊2／＊2 or＊3突變型純合子差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率分析（±s） %

表1 ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率分析（±s） %

CYP2C19基因型 n 服藥前 服藥后CYP2C19＊1／＊1 10 65.4±7.3 27.6±4.1 CYP2C19＊1／＊2 or＊3 10 67.3±9.0 31.5±2.7 CYP2C19＊2／＊2 or＊3 10 65.8±7.0 34.0±3.4

3 討 論

氯吡格雷是一種常用的血小板聚集抑制劑，臨床療效顯著，備受關(guān)注。氯吡格雷臨床效果存在明顯的個(gè)體差異，實(shí)驗(yàn)室檢測ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率降低不顯著，未能達(dá)到預(yù)期的抗血小板作用，被稱為“氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）”。國外研究約20%的用藥者療效不佳［6］。導(dǎo)致氯吡格雷臨床效果個(gè)體差異的主要因素是CYP2C19基因多態(tài)性，該基因編碼的酶作用于氯吡格雷前體的活性轉(zhuǎn)化。其中CYP2C19＊1／＊1基因型轉(zhuǎn)化效率最高（強(qiáng)度代謝，EM），CYP2C19＊1／＊2 or＊3突變型雜合子次之（中度代謝，IM），CYP2C19＊2／＊2 or＊3突變型純合子最差（弱代謝，PM）。東亞人群弱代謝突變型分布頻率（20%）遠(yuǎn)高于高加索人群（3%～5%）［7］。

基因多態(tài)性分析的方法有基因測序、限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)分析法（RFLP）和ARMS PCR等?；驕y序是基因分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但操作復(fù)雜，儀器昂貴。限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)分析法同樣操作步驟多，易污染，靈敏度低。ARMS PCR操作簡便、快捷，靈敏度高，對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較低，適合基層醫(yī)院的使用。本研究基于ARMS PCR技術(shù)，建立了CYP2C19基因多態(tài)性分析方法。并且經(jīng)基因測序驗(yàn)證，二者的檢測結(jié)果完全一致。

ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率分析結(jié)果顯示，3組CYP2C19基因型個(gè)體服藥前ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），服藥后3組個(gè)體均較服藥前明顯降低（P＜0.01），其中CYP2C19＊1／＊1野生型組服藥后聚集率明顯低于CYP2C19＊1／＊2 or＊3突變型雜合子和CYP2C19＊2／＊2 or＊3突變型純合子（P＜0.05），CYP2C19＊1／＊2 or＊3突變型雜合子與CYP2C19＊2／＊2 or＊3突變型純合子差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CYP2C19＊1／＊1，CYP2C19＊1／＊2 or／＊3，CYP2C19＊2／＊2 or＊3基因型個(gè)體服用氯吡格雷的療效逐步降低，進(jìn)一步證明了遺傳因素對(duì)藥物效果的影響。

綜上所述，本文建立了一種CYP2C19簡便快捷的基因分型方法，進(jìn)一步證實(shí)了CYP2C19基因型與氯吡格雷療效個(gè)體化差異的關(guān)系，彰顯了藥物基因組學(xué)分析的重要性。通過對(duì)受試者基因分型檢測，判定受試者的藥物代謝速率類型，從而輔助醫(yī)生合理調(diào)整藥物劑量，提高藥物的有效性，這也符合個(gè)體化醫(yī)學(xué)發(fā)展的趨勢。

［1］ Kazui M，Nishiya Y，Ishizuka T，et al.Identification of the human cytochrome P450 enzymes involved in the two oxidative steps in the bioactivation of clopidogrel to its pharmacologically active metabolite［J］.Drug Metab Dispos，2010，38（1）：92-99.

［2］ Wilkinson GR.Drug metabolism and variability among patients in drug response［J］.N Engl J Med，2005，352（21）：2211-2221.

［3］ Damani SB，Topol EJ.The case for routine genotyping in dual-antiplatelet therapy［J］.J Am Coll Cardiol，2010，56（2）：109-111.

［4］ Xie HG，Kim RB，Wood AJ，et al.Molecular basis of ethnic differences in drug disposition and response［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2001，41：815-850.

［5］ Beitelshees AL，Horenstein RB，Vesely MR，et al.Pharmacogenetics and clopidogrel response in patients undergoing percutaneous coronary interventions［J］.Clin Pharmacol Ther，2011，89（3）：455-459.

［6］ Snoep JD，Hovens MM，Eikenboom JC，et al.Clopidogrel nonresponsiveness in patients undergoing percutaneous coronary inter-vention with stenting：A systematic review and meta-analysis［J］.Am Heart J，2007，154：221-231.

［7］ Tazaki J，Jinnai T，Tada T，et al.Prediction of clopidogrel low responders by a rapid CYP2C19 activity test［J］.J Atheroscler Thromb，2012，19（2）：186-193.