遼東楤木皂苷分布特性的研究

黃福山，趙恒田*，周克琴，李富恒，張渴望

(1.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；2.黑龍江省林下經(jīng)濟(jì)資源研發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江 哈爾濱 150081；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150030)

遼東楤木[Araliaelata(Miq.) Seem.]，又稱龍牙(芽)楤木，俗稱刺龍牙、刺嫩芽、刺老鴉、東北野香椿等，是一種食藥兼用型的五加科(Araliaceae)楤木屬(Aralia)植物，為多年生落葉小喬木[1]。其食用器官為嫩芽，富含多種維生素、氨基酸和微量元素等，是深受國內(nèi)外人們喜食的野生蔬菜[2]；國內(nèi)外學(xué)者對遼東楤木植株的化學(xué)成分、藥用價(jià)值和藥理的研究較多，主要集中在對根皮、莖皮的研究[3-6]，對植株中有效活性成分三萜皂苷的分布特性報(bào)道較少，近年來對葉片的化學(xué)成分研究逐漸深入[7]，且葉片生長快速、再生能力強(qiáng)、總量多，是未來開發(fā)的重要原料。研究表明，遼東楤木的根、莖、葉等器官中均含有多種三萜皂苷[8-10]，主要皂苷元為齊墩果酸類化合物[11]，其可以作為生產(chǎn)中藥制劑的原料，具有增強(qiáng)體質(zhì)、抗除疲勞、抗炎保肝、降血糖血脂、抗癌、抗病毒等功效。同其他藥用植物一樣，遼東楤木植株有效活性成分及含量因分布區(qū)域、生長季節(jié)及植株生理狀態(tài)等不同而有較明顯差別。本實(shí)驗(yàn)通過分析遼東楤木植株的不同器官和部位，以及不同生育時(shí)期和光照條件下的葉片皂苷含量變化，揭示遼東楤木皂苷分布特性，為確定最佳的藥源采集部位和采集時(shí)間，實(shí)現(xiàn)高效合理地利用遼東楤木資源提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；KH-250DV型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器(功率250 W，頻率40 kHz，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；恒溫水浴鍋(余姚市亞星儀器儀表有限公司)；JM5702型號電子天平(余姚紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司)；植物粉碎干磨機(jī)。

1.2 材料

樣品采自中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所(哈爾濱市)野生種質(zhì)園，由中科院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所研究員鑒定為遼東楤木[Araliaelata(Miq.) Seem.]。遼東楤木1～2年生植株不能結(jié)實(shí)，高約1.5～2.5 m，直徑約2～3 cm；3年及以上植株為結(jié)實(shí)植株，高約2.5～5 m，直徑約3～9 cm。植株的生長環(huán)境為中溫帶大陸性季風(fēng)氣候，四季較分明，年平均氣溫3.5 ℃；≥10 ℃積溫為2 000～3 200 ℃，全年日照時(shí)數(shù)2 600～2 900 h；年平均降水量約為350～650 mm；年平均蒸發(fā)量為659.8 mm；栽培土壤為中厚層黑土，養(yǎng)分豐富，有機(jī)質(zhì)含量為50.64 g·kg-1，pH值6.8。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、乙醚、正丁醇、甲醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸均為分析純；水為蒸餾水。

2 方 法

2.1 試驗(yàn)處理

選取1～8年植株的根和莖的皮部及葉片(8月中旬采集)，測定其皂苷的含量；選擇2、4年株齡植株分別剝?nèi)「颓o的皮部、木質(zhì)部和髓，測定各部位中皂苷的含量；選擇2、4年株齡植株的不同生育期的葉片，每15天取一次樣，測定皂苷含量，分析不同時(shí)期的葉片中皂苷的積累特點(diǎn)；采用黑色遮陽網(wǎng)對遼東楤木植株進(jìn)行不同遮光處理，使其透光率分別為25%、50%、75%、100%，每30天取一次樣，共取樣4次，測定其中的皂苷含量，分析光照條件對葉片皂苷積累的影響。

將樣品采集后，置于烘箱中60 ℃烘干至恒重，粉碎，過40目篩，干燥器中保存，備用。

2.2 皂苷含量的測定

遼東楤木皂苷提取及含量分析采用超聲提取比色測定法[12]。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加甲醇溶解定容至10 mL，制成濃度為1.0 mg/mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液20、40、60、80、100、120 μL，分別加入6支干燥具塞試管中，70 ℃水浴揮干甲醇，各加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，于60 ℃恒溫水浴中加熱15 min，取出，流水冷卻5 min，加冰醋酸5 mL，搖勻，隨行試劑空白，在540 nm波長處測定吸光度。3次平行重復(fù)，以3次吸光度的平均值為縱坐標(biāo)，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為：y=0.005x+0.006 2，R2=0.998 5，在20.0～120.0 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 楤木皂苷含量的測定

精密稱取遼東楤木樣品粉末0.5 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入70%乙醇溶液20 mL，超聲提取(超聲溫度為60 ℃，超聲頻率為40 kHz，超聲功率250 W)60 min，提取液過濾后濃縮蒸干，加水30 mL，加入乙醚30 mL脫脂3次，然后用水飽和正丁醇20 mL萃取3次，合并正丁醇萃取液濃縮蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒁浦?0 mL容量瓶中，定容，搖勻即得供試品溶液。

精密吸取供試品溶液20 μL加入到干燥具塞試管中，水浴揮干甲醇，各加入新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，于60 ℃恒溫水浴中加熱15 min，取出，流水冷卻5 min，加冰醋酸5 mL，搖勻，隨行試劑空白，在540 nm波長處測定吸光度。由線性回歸方程計(jì)算齊墩果酸的含量，根據(jù)齊墩果酸與楤木皂苷 A、B、C的相對分子質(zhì)量之比進(jìn)行換算[13]，得出樣品中的楤木皂苷量。皂苷含量=樣品溶液中皂苷量(mg)/樣品質(zhì)量(g)×100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 植株不同器官皂苷分布

根皮、莖皮和葉片中均含有楤木皂苷(圖1)，同一時(shí)期采集的根皮和莖皮中的皂苷含量隨株齡的增加而增加，皂苷含量增幅較為平穩(wěn)，根皮中皂苷含量高于莖皮；葉片中皂苷含量在1～6年株齡范圍內(nèi)呈增長趨勢，6年生植株葉片皂苷含量最高，為8.9%，8年植株葉片中皂苷含量高于2年生植株葉片，但低于4～6年植株葉片；1～6年植株的根皮中皂苷含量最高，其次為葉片，莖皮中皂苷含量相對最低。

圖1 不同株齡植株皂苷分布

圖2 根和莖不同部位皂苷含量

3.2 植株不同部位皂苷分布

在根和莖的各部位中(圖2)，皮部、木質(zhì)部和髓的皂苷含量均表現(xiàn)差異顯著。皮部中皂苷含量最高，木質(zhì)部次之，髓中最低。同齡植株的各部位中，莖皮部中皂苷含量約是木質(zhì)部的3.4倍，根皮部中皂苷含量是木質(zhì)部的4倍以上。4年植株根和莖的皮部和木質(zhì)部中皂苷含量均高于2年植株，但髓中的皂苷含量低于2年植株。

3.3 不同葉齡葉片皂苷動(dòng)態(tài)變化

不同生長發(fā)育時(shí)期的葉片中皂苷含量變化較大(表1，圖3)，2年植株的葉片皂苷含量隨時(shí)間的延長呈先增加后減少趨勢，6、7月份增長幅度較大，而后增幅趨于平緩，8月上中旬葉片皂苷含量最高，為6.9%，隨后下降。4年植株葉片皂苷含量有兩個(gè)高峰期，7月初和8月中旬皂苷含量較高，分別為8.1%和8.8%，7月中下旬為皂苷含量低峰期，可能是由于生殖生長的影響。在整個(gè)生長發(fā)育期間，4年植株葉片的皂苷含量均高于2年生植株葉片。

表1 遼東楤木生育期

圖3 葉片中皂苷含量的動(dòng)態(tài)變化

3.4 不同光照條件下葉片皂苷分布

不同光照條件下葉片皂苷含量隨處理時(shí)間的延長均呈先增加后減少的趨勢(圖4)，在整個(gè)光照處理過程中，75%透光率和100%透光率(全光照)條件處理的葉片發(fā)育形態(tài)指標(biāo)及皂苷含量基本一致，在整個(gè)生長發(fā)育期皂苷含量含量平均高于全光條件0.60%；50%透光率處理的葉片45天時(shí)皂苷含量與全光照條件差別不大，隨著處理時(shí)間的延長，皂苷含量明顯低于對照組；25%透光率處理的葉片皂苷含量在處理過程中均低于全光照條件，在生長發(fā)育末期葉片皂苷含量為2.86%，僅為全光照條件葉片皂苷含量的50%。葉片中皂苷的形成和積累需要足夠的光照，75%透光率處理對皂苷的形成和積累影響較小，但對推遲葉片干枯脫落有一定好處，50%和25%透光率處理對葉片皂苷的積累無益，且會(huì)促使葉片提前干枯，亦不利于植株生長。

圖4 不同光照條件下葉片皂苷含量變化

4 結(jié)論與討論

植物的次生代謝是植物在長期進(jìn)化中與環(huán)境相互作用的結(jié)果，次生代謝產(chǎn)物在植物提高自身保護(hù)和生存競爭能力、協(xié)調(diào)與環(huán)境關(guān)系上充當(dāng)著重要的角色，其產(chǎn)生和變化比初生代謝產(chǎn)物與環(huán)境有著更強(qiáng)的相關(guān)性和對應(yīng)性[14-15]。藥用植物在其生長發(fā)育的各個(gè)時(shí)期所含的藥用成分和含量有很大差別，原因較為復(fù)雜，可能與不同的生長地點(diǎn)、生長季節(jié)、器官部位及本身的代謝生長發(fā)育特性等有關(guān)系，在初級代謝中間產(chǎn)物積累到一定程度并在調(diào)節(jié)次生代謝的酶促作用下，次生代謝產(chǎn)物含量才會(huì)出現(xiàn)高峰[16]。

遼東楤木根皮、莖皮和葉片是皂苷(次生代謝產(chǎn)物)的主要積累場所，以根皮中含量最高，葉片其次，莖皮含量相對少。根皮和莖皮中的皂苷含量積累規(guī)律相似，均逐年增長，這與前蘇聯(lián)和中國專家已有的報(bào)道[17-19]有相似之處，但在測定的皂苷含量方面有一定差異，可能是由于地域、氣候和測定方法的差異造成的。在人工栽培條件下，遼東楤木第2～6年生長較快，植株高度增長約3.0～5.0 m，直徑增長約2.0～4.5 cm，第6年之后植株高度增長較少，直徑增長速度也變慢，很多植株生長6～8年時(shí)出現(xiàn)脫皮死亡現(xiàn)象，根部萌出新枝條，可能是衰老更替的一種表現(xiàn)，具體原因未見有報(bào)道。6年以上植株的根莖皮在皂苷含量和總量上都相對較高，最適宜作為藥源材料。遼東楤木的葉片皂苷含量隨株齡的增長呈增加趨勢，4年以上植株成熟的葉片在大小、顏色差異小，皂苷含量較高，適宜作為藥源材料；部分8年生植株受脫皮的影響，葉片出現(xiàn)黃化、卷曲等營養(yǎng)缺乏癥狀，皂苷含量相對低。

葉片中皂苷含量動(dòng)態(tài)具有明顯的季節(jié)變化規(guī)律，由枝芽萌發(fā)期到結(jié)果期，植物體生理活動(dòng)活躍，葉片中營養(yǎng)物質(zhì)積累迅速，皂苷類物質(zhì)也有一定的增長和積累；隨著葉片發(fā)育的不斷成熟，外界溫度的升高，酶的活性增強(qiáng)，光合能力增強(qiáng)，用于合成皂苷類物質(zhì)的底物增多，皂苷類物質(zhì)的生物合成作用也增強(qiáng)，在8月上中旬時(shí)，皂苷含量積累達(dá)到最高峰，此時(shí)葉片適宜作為藥源材料，但采集量不宜過大，以免影響植物結(jié)實(shí)；4年以上植株葉片在7～8月皂苷含量有一個(gè)低峰，可能是由于生殖生長消耗大量的物質(zhì)和能量的影響，皂苷合成減弱或發(fā)生轉(zhuǎn)移；9～10月份，外界溫度下降，光合作用和呼吸作用有所減弱，葉片逐漸變黃脫落，次生代謝物可能因內(nèi)源的和外源因素的調(diào)節(jié)合成較弱或停止，也可能因發(fā)生轉(zhuǎn)移或降解而損失。從不同光照條件下葉片的生長狀況和皂苷含量變化看，遼東楤木屬喜光植物，但也有一定的耐陰性，75%透光率的光照適宜葉片的生長和皂苷積累。目前，中藥主要采用皂苷含量較高的根皮做為藥源材料，此方法嚴(yán)重破壞資源，近些年在葉片中亦發(fā)現(xiàn)了更多的皂苷成分，藥用價(jià)值顯著，并且葉片再生能力強(qiáng)、總量多，根據(jù)葉片中皂苷的積累特點(diǎn)，適量采集8月中旬的葉片，能更充分合理的利用楤木資源。

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