朝鮮淫羊藿藥材HPLC指紋圖譜研究

陳 婷，王 冰，劉 樅，許 亮

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600)

中藥淫羊藿為小檗科植物淫羊藿(Epimediumbrevico-rnumMaxim.)、箭葉淫羊藿[Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.) Maxim.]、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim.)、巫山淫羊藿(EpimediumwushaneirseT.S.Ying)或朝鮮淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)的干燥地上部分，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效，用于陽(yáng)痿遺精、筋骨萎軟、風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣及更年期高血壓等[1-3]。本文對(duì)淫羊藿屬中的朝鮮淫羊藿藥材進(jìn)行了研究，采用高效液相色譜法建立朝鮮淫羊藿藥材的指紋圖譜[4]，建立了更可靠的分析方法，為該藥材的質(zhì)量分析提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

通過(guò)對(duì)朝鮮淫羊藿藥材HPLC指紋圖譜條件的摸索，確定出分離度最佳的色譜條件，并在此條件下對(duì)同一批次朝鮮淫羊藿的指紋圖譜進(jìn)行對(duì)照品標(biāo)定和譜圖的分析處理得出該批次朝鮮淫羊藿的相似度，建立該藥材的指紋圖譜分析方法，為科學(xué)評(píng)價(jià)及有效控制該藥材的質(zhì)量提供可行方法和可靠依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀；電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司，JD200-3G)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，KQ3200B)；無(wú)水乙醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 分析純)；甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 分析純)；乙腈(天津市大茂化學(xué)試劑廠 色譜純)；水(大連娃哈哈飲用水有限公司)；淫羊藿苷對(duì)照品、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C(中國(guó)食品藥品檢定研究所)；朝鮮淫羊藿藥材采于遼寧新賓，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王冰教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈(B)-水溶液(A)，檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。具體色譜條件見(jiàn)表1[5-8]。

表1 色譜條件

2.2 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C對(duì)照品適量，加甲醇溶解，加甲醇溶液制成濃度分別為0.160、0.140、0.155、0.175 mg/mL的對(duì)照品母液。

2.3 供試品溶液制備

取同一批次朝鮮淫羊藿藥材10份，粉碎，過(guò)40目篩。分別精密稱定藥材粗粉2.5 g，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇45 mL，回流提取兩次，每次90 min。放冷，合并兩次提取液，抽濾，濾液于100 mL容量瓶中定容。取25 mL溶液于蒸發(fā)皿中蒸干，用甲醇定容于25 mL容量瓶中。取2 mL溶液于10 mL容量瓶中定容，樣品溶液經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，備用。

2.4 HPLC色譜測(cè)定法

分別精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，同法測(cè)定，即得。對(duì)照品及供試品圖譜見(jiàn)圖1。

A.對(duì)照品譜圖 B.供試品譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1號(hào)樣品溶液依次于不同時(shí)間(0、2、4、8、12、24 h)進(jìn)樣測(cè)定峰面積值，測(cè)得淫羊藿苷峰面積的RSD 1.6%，朝藿定A峰面積的RSD 1.5%，朝藿定B峰面積的RSD 1.4%，朝藿定C峰面積的RSD 1.0%，由以上結(jié)果得知，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C在室溫放置24 h穩(wěn)定。

2.5.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。淫羊藿苷峰面積的RSD 0.4%，朝藿定A的RSD 0.4%、朝藿定B的RSD 0.5%、朝藿定C的RSD 0.5%。由此結(jié)果可以得出，進(jìn)樣精密度結(jié)果符合規(guī)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取1號(hào)樣品粉末2.5 g，共6份，按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備條件進(jìn)行制備，并按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得淫羊藿苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.55%，RSD 1.24% ，朝藿定A的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%，RSD 1.16%，朝藿定B的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.18%，RSD 1.30%，朝藿定C的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%，RSD 1.28% 。由以上結(jié)果得知，樣品的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果符合含量測(cè)定的方法學(xué)要求。

2.6 指紋圖譜的建立及分析

2.6.1 供試品測(cè)定

在上述色譜條件下，測(cè)定10批朝鮮淫羊藿藥材在2.3項(xiàng)下的提取液，記錄圖譜。對(duì)10批供試品結(jié)果進(jìn)行分析、比較，典型色譜圖見(jiàn)圖1中供試品譜圖。

分別把10批朝鮮淫羊藿指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)的操作規(guī)范(范本2004A)軟件，對(duì)保留時(shí)間5～65 min的色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正后，自動(dòng)匹配，生成朝鮮淫羊藿共有模式(圖2)。

圖2 10批供試品HPLC指紋圖譜

2.6.2 指紋圖譜的相似度計(jì)算

采用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥指紋圖譜相似度軟件2004A計(jì)算均值相似度，10批朝鮮淫羊藿藥材指紋圖譜的相似度分別為0.992、0.984、0.994、0.995、0.998、0.998、0.994、0.998、0.984。表明該批朝鮮淫羊藿較均勻。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)曾對(duì)乙腈-水流動(dòng)相的比例及柱溫對(duì)分離度的影響進(jìn)行了考察。通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相比例及柱溫，最終確定乙腈-水梯度洗脫條件為:0～24 min(A:25%→27%)，24～43 min(A:27%→48%),43～63 min(A:48%→80%),63～69 min(A:80%→100%)，柱溫25 ℃。在此條件下朝鮮淫羊藿的色譜峰信息量豐富、各色譜峰分離度較好，保留時(shí)間適中，峰形良好，滿足進(jìn)行指紋圖譜分析的要求，故確定該洗脫系統(tǒng)作為朝鮮淫羊藿的HPLC指紋圖譜檢測(cè)的流動(dòng)相。

在上述色譜條件下，經(jīng)與參照物比較，精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)及重現(xiàn)性試驗(yàn)中所得RSD值均小于5%，符合有關(guān)高效液相色譜指紋圖譜分析方法的方法學(xué)考察要求，表明該方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性較好。

淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C為淫羊藿屬植物共有成分，但其總成分含量在朝鮮淫羊藿中含量較高，且在270 nm下的吸收相對(duì)其他峰較好。經(jīng)與對(duì)照品比較，在19～27 min內(nèi)分離度良好且與對(duì)照品相匹配，故在建立朝鮮淫羊藿指紋圖譜時(shí)將其列入特征峰范圍。

將HPLC法繪制的譜圖導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度軟件2004A計(jì)算均值相似度可知，10份樣品的相似度均在0.98以上，且保留時(shí)間較穩(wěn)定，說(shuō)明該批次朝鮮淫羊藿藥材相似度良好，質(zhì)量較均一。并且在該實(shí)驗(yàn)中所建立的指紋圖譜條件具有良好的穩(wěn)定性和可靠性，為朝鮮淫羊藿的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了更豐富的信息。

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