紅果參葉中總黃酮的提取工藝初步探討

陳 雅，李 貴，吳帥玲，張永康，陳功錫，*

(1.吉首大學(xué) 生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院；2.植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000)

紅果參系桔?？?Campanulaceae)金錢(qián)豹屬(Campanumoea)長(zhǎng)葉輪鐘草[Campanumoealancifolia(Roxb.) Merr.]的俗稱(chēng)，為湘西苗族傳統(tǒng)藥用植物，同時(shí)由于其葉常綠、花果美麗，又深受人們喜愛(ài)，因此可以做觀賞植物。該植物為多年生，直立或蔓性草本，莖高可達(dá)3 m，肉質(zhì)根胡蘿卜狀?！吨腥A本草》記載其有“治療勞倦氣虛乏力、跌打損傷、腸絞痛”等效用。長(zhǎng)期以來(lái)，湘西苗族人民以其肉質(zhì)根代替人參作為大病初愈后的滋補(bǔ)品，常稱(chēng)其為“南方人參”。其果實(shí)稱(chēng)為“蜘蛛果”、“肉算盤(pán)”[1-2]，美味可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，男女老少均喜食用。在春夏生長(zhǎng)旺季及冬季，老百姓常采其嫩葉作為蔬菜炒食，不僅風(fēng)味獨(dú)特、美味可口，還有一定的保健功效。

黃酮類(lèi)化合物在植物中廣泛存在，并具有多種多樣的生物活性。有研究表明黃酮類(lèi)化合物具有防治神經(jīng)性病變、延緩衰老[3]、加強(qiáng)DNA的保護(hù)[4]、治療冠心病、抗癌和抗HIV病毒等功效[5]。同時(shí)在食品工業(yè)上，許多以黃酮類(lèi)化合物為功能因子的保健食品被開(kāi)發(fā)，如孫建華[6]研制的黃酮綠豆飲料，龐霞[7]研制的富含荷葉黃酮的黃酒，烏氈帽酒業(yè)有限公司[8]研制的含有竹葉黃酮的清爽型黃酒等。含有黃酮類(lèi)物質(zhì)的藥物，保健品越來(lái)越受到人們的青睞，其社會(huì)需求量大，市場(chǎng)前景廣闊，因此從植物中尋找黃酮資源越來(lái)越受到人們的重視。紅果參全株是寶，果實(shí)中含有的化學(xué)成分主要有糖類(lèi)、生物堿、黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、蒽醌、甾體、三萜類(lèi)、有機(jī)酸等[2]，經(jīng)實(shí)驗(yàn)初步測(cè)定紅果參葉中含有黃酮，探究紅果參葉總黃酮提取工藝，可為紅果參的開(kāi)發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)，有助于其綜合開(kāi)發(fā)利用。

關(guān)于黃酮的提取方法多種多樣，如熱水提取法、酶解法、超濾法、超臨界CO2萃取法等[9]，各種提取方法各有特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇超聲法提取紅果參葉中的總黃酮，相對(duì)傳統(tǒng)的醇提取法而言，縮短了提取時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 材料

紅果參葉于2011年12月采自湖南省海拔230 m的湘西吉首大學(xué)紅果參試驗(yàn)基地。采樣時(shí)，隨機(jī)摘取紅果參的幼葉。采后將葉子迅速洗凈、涼干，于60 ℃下烘24 h、粉碎,裝袋，密封貯存，備用。

1.1.2 儀器

UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度儀，日本島津公司；SHB-3循環(huán)水多用真空泵，西安禾普生物儀器有限公司；F2102型微型植物粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限責(zé)任公司；FA2104N型萬(wàn)分之一電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；DCTZ-2000型三頻多用途恒溫超聲提取機(jī)，北京弘祥隆生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；NaNO2、NaOH、Al(NO3)3、C2H5OH，所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.6 mg，用體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶解，并完全移入50mL容量瓶中，用30%乙醇定容[10]，配置成212 mg/L的蘆丁溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取7支試管依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為212 mg/L蘆丁溶液0,1,2,3,4,5,6,7 mL，加蒸餾水補(bǔ)充至10 mL，往各試管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO21.5 mL，搖勻，放置6 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al(NO3)31.5 mL，6 min后再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaOH溶液20 mL，混勻,20 min后以第一管為空白參比，采用比色法在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度[10]。以吸光度為橫坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 溶劑法提取及含量測(cè)定

精確稱(chēng)取1 g干樣，在一定條件下用乙醇浸提超聲后抽濾，濾液用30%的乙醇定容到50 mL容量瓶中；準(zhǔn)確移取4.00 mL于50 mL容量瓶中，用水再次定容。準(zhǔn)確移取5.00 mL于錐形瓶中加水5.00 mL，按照1.2.2中所述的方法測(cè)定樣品中總黃酮提取得率(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

黃酮提取得率計(jì)算公式：

1.2.4 提取條件優(yōu)化

1.2.4.1 乙醇濃度的選擇

稱(chēng)取干樣，在固液比為1∶20，超聲提取溫度為35 ℃，功率為700 W，超聲時(shí)間為10 min的條件下，分別用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)提取3次，計(jì)算得率。

1.2.4.2 料液比的選擇

稱(chēng)取干樣，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30(g/mL)，于60%的乙醇溶液，在超聲提取溫度為35 ℃，功率為700 W條件下超聲10 min，進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)提取3次，計(jì)算得率。

1.2.4.3 提取時(shí)間的選擇

稱(chēng)取干樣，在料液比1∶10、乙醇濃度為60%，在超聲提取溫度為35 ℃，功率為700 W的條件下分別超聲5、10、15、20、30 min，進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)提取3次，計(jì)算得率。

1.3 多因素正交實(shí)驗(yàn)

為尋求最佳工藝提取條件組合，在單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)、三個(gè)因素為考察因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，以總黃酮提取得率為指標(biāo)，采用了L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)，并確立因素水平表，見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)得蘆丁質(zhì)量濃度Y(μg/mL)及對(duì)應(yīng)的吸光度X，見(jiàn)圖1所示。其標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=89.745X-0.019 6；相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，線性關(guān)系良好，可用作紅果參葉中總黃酮提取得率的測(cè)定。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取條件與得率的關(guān)系

2.2.1 乙醇濃度對(duì)提取得率的影響

由圖2可知，紅果參葉中總黃酮在提取時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)乙醇濃度峰值，分別為80% 乙醇(5.37%)和50% 乙醇(5.26%)；當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí)，黃酮提取得率最低為4.52%；其次為60%、70%，黃酮提取得率依次為4.98%、5.01%；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：用80%乙醇提取，黃酮得率可達(dá)到最大；另外，50%乙醇作為提取溶劑可有效節(jié)約試劑。因此，超聲提取的最適乙醇濃度為80%。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取得率的影響

由圖3可知，隨超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取率先上升，而后又下降，造成這種現(xiàn)象的原因是在長(zhǎng)時(shí)間超聲作用下，提取率逐漸接近極限，提取物中雜質(zhì)也隨之增加，黃酮提取得率反而降低，由上表分析可知提取時(shí)間為10 min、15 min、20 min時(shí)黃酮的提取率較高，分別為4.88%、4.90%、4.93%其中提取時(shí)間20 min時(shí)黃酮提取得率最高。

圖2 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.2.3 料液比對(duì)提取得率的影響

不同的料液比會(huì)對(duì)目標(biāo)成分的提取率產(chǎn)生影響，在一定范圍內(nèi)溶劑量越多越利于目標(biāo)物浸出，但是過(guò)高的溶劑原料比會(huì)導(dǎo)致提取得率下降。本實(shí)驗(yàn)中在1∶10 到1∶20 的范圍內(nèi)提取得率隨料液比增大而增大，在1∶20 到1∶25 的范圍內(nèi)提取得率隨料液比增大而減小，在料液比1∶25之后提取得率又開(kāi)始增大，在料液比為1∶30時(shí)黃酮提取得率達(dá)到最高值為5.48%，但從總體來(lái)看隨料液比的增大，總黃酮提取得率增加。

圖4 料液比對(duì)提取率的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)1.3的實(shí)驗(yàn)方案開(kāi)展正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，所得結(jié)果如表2所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在正交實(shí)驗(yàn)中，黃酮的提取得率由公式計(jì)算而來(lái)。通過(guò)分析得出紅果參葉中黃酮類(lèi)化合物最佳提取條件為85%的乙醇濃度、提取時(shí)間10 min、料液比1∶30。從表2可知：黃酮提取率的影響按大小次序排列分別為RC>RA>RB，即料液比>乙醇濃度>提取時(shí)間，初步確定從紅果參葉中提取黃酮類(lèi)物質(zhì)的較佳方案為：A3B2C3，即最佳提取條件為85%的乙醇濃度、提取時(shí)間10 min、料液比1∶30。

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

按最佳提取條件85%的乙醇濃度、提取時(shí)間10 min、料液比1∶30進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，設(shè)計(jì)3組平行試驗(yàn)，取平均值，得最佳工藝下黃酮提取率為4.76%。

3 結(jié) 論

該實(shí)驗(yàn)初步探究了紅果參葉中總黃酮的最佳提取工藝，確定了各因素對(duì)紅果參葉中總黃酮提取率的影響順序?yàn)镃(料液比)>A(乙醇濃度)>B(提取時(shí)間) ；最佳提取工藝條件為 85%的乙醇、10 min的提取時(shí)間、1∶30的料液比。在此條件下，黃酮類(lèi)化合物提取率可達(dá)4.76%。

從以上初步探究的結(jié)果來(lái)看，紅果參葉中總黃酮含量較高，但是其分離純化工藝、生理活性等探究工作有待進(jìn)一步開(kāi)展。為使紅果參葉中的黃酮提取實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，可進(jìn)一步探索紅果參葉中總黃酮提取參數(shù)，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

與桔梗科其他兩種最重要的藥用植物相比較，黨參[11](根)的黃酮提取得率為2.5%，桔梗[12](根部)的黃酮提取得率為2.87%，二者黃酮提取得率都低于紅果參的葉。此外，檀香葉[13]中總黃酮提取得率可達(dá)3.24%，黃皮[14]葉中的可達(dá)3.62%，紫蘇[15]葉中的可達(dá)4.03%，銀杏[16]中的可達(dá)5.14%，紅果參葉中總黃酮的含量較紫蘇、黃皮、檀香葉中的高，稍低于銀杏葉?？梢?jiàn)，紅果參葉中的黃酮含量豐富，可能具有更高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李貴，張永康，陳功錫，等.湘西民族藥用植物紅果參果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分初步分析[C]∥第十屆全國(guó)藥用植物及植物藥學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集，2011：113.

[2] 李貴，張永康，李輝，等.湘西民族藥用植物紅果參果實(shí)化學(xué)成分初步分析[C]∥第十屆全國(guó)藥用植物及植物藥學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集，2011：114.

[3] Jeremy P E S.Flavonoids and brain health: multiple effects underpinned by common echanisms[J]. Genes Nutr,2009(4)：243-250.

[4] Jennifer D D.Flavone: The Molecular and Mechanistic Study of How a Simple Flavonoid Protects DNA from Oxidative Damage[J].East Tennessee State University, Department of Biochemistry and Molecular Biology,December 2003.

[5] 方從兵，宛曉春，江昌俊.黃酮類(lèi)化合物生物合成的研究進(jìn)展(綜述)[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005(4)：498-504.

[6] 孫建華.綠豆黃酮的堿法提取及黃酮綠豆飲料的制備方法[P].中國(guó)專(zhuān)利：CN101999667A，2011-04-06.

[7] 龐霞.一種含荷葉黃酮的特型黃酒的釀制方法[P].中國(guó)專(zhuān)利：CN201110164309.0，2011-6-20.

[8] 烏氈帽酒業(yè)有限公司.一種含有竹葉黃酮的清爽型黃酒的釀制方法及黃酒[P].中國(guó)專(zhuān)利：CN201110028369.X，2011-1-26.

[9] 龍海榮.菱角殼黃酮的提取、分離及抗氧化活性研究[D].廣西：廣西大學(xué)，2009:5-7,22.

[10] 李鵬，陶亮亮，丁敬敏，等.竹葉總黃酮提取工藝研究[J].食品工程，2011(5)：151.

[11] 薛長(zhǎng)暉.微波法提取黨參黃酮的最佳提取工藝研究[J].糧油加工，2008(11)：124-126.

[12] 唐生永，陳曉平.桔?？傸S酮的提取及純化工藝研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊)，2010(3)：20-22.

[13] 余文新，莊滿賢，林勵(lì)，等.正交設(shè)計(jì)優(yōu)選檀香葉總黃酮提取工藝[J].食品工業(yè)科技，2012(8)：284-286.

[14] 周燕芳.超聲波法提取黃皮葉中黃酮工藝的優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(7)：1433-1435.

[15] 榮維燕，郭斌.超聲波輔助提取紫蘇葉總黃酮的工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(34)：17070-17071.

[16] 倪林，葉明，楊必偉.微波-高壓提取銀杏葉黃酮工藝條件優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(10)：199-205.