虎刺抗氧化和抗菌活性研究

馬瑞麗，李倩倩，徐秀泉，李 梅，湯 建*，歐陽(yáng)臻

(1.江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 2.定西市旱農(nóng)科研推廣中心，甘肅 定西 743000)

虎刺(DamnacanthusindicusGaertn. f.)，又名繡花針，小黃連，分布于長(zhǎng)江流域及以南地區(qū)，中醫(yī)上主要用于治療肝炎、風(fēng)濕痹痛、黃疸水腫等病癥[1-2]，同時(shí)也是瑤藥中具有代表性的藥材之一，用于治療用于肝炎、身體虛弱及小兒疳積等[3]。該植物化學(xué)成分報(bào)道較多的是以大黃素為代表的蒽醌類化合物[4-7]，關(guān)于該植物中的黃酮類化合物的報(bào)道主要以含量測(cè)定為主[8]。本文中采用清除DPPH自由基模型、還原力模型以及總抗氧化力模型評(píng)價(jià)虎刺提取物和各萃取部位的抗氧化能力、抑菌活性，以及與樣品中總黃酮含量的關(guān)系。以期對(duì)虎刺的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

虎刺藥材于2009年9月購(gòu)于亳州藥材市場(chǎng)(產(chǎn)地 湖南)，經(jīng)本院歐陽(yáng)臻教授鑒定為茜草科虎刺屬植物Damnacanthusindicus(Linn) Gaertn. f.。全草粉碎(10～20目) 后冷藏備用。

蘆丁對(duì)照品 中國(guó)藥品生物制品鑒定所；1, 1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH.) 美國(guó)Sigma公司；維生素C(分析純)、95%乙醇(分析純)、去離子水、雙純水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2102PCS型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司； ZF超聲波清洗機(jī) 上海致豐電子科技有限公司； LOOYE ZX98-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海魯伊工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

秤取虎刺藥材(10～20目)100 g，加入80%乙醇500 mL，于45℃下超聲提取20 min，抽濾后濾渣重復(fù)提取2次。提取液濃縮至無(wú)醇味(約120 mL)，取其中20 mL濃縮液蒸除溶劑，得到3.5 g浸膏。剩余部分分別用100 mL×3石油醚，二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，蒸除溶劑后得到3個(gè)萃取部位，分別為0.3 g，1.2 g和2.6 g。剩余水相經(jīng)HP20樹(shù)脂柱，水洗除去無(wú)機(jī)鹽、黏液、寡糖等，90%乙醇洗脫，90%部位蒸除溶劑后凍干，得2.1 g粉末。樣品密閉冷藏于-20℃冰箱中備用。

1.3.2 抗氧化活性的測(cè)定

1.3.2.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9-10]方法， 1 mL不同濃度樣品溶液(0～200 μg/mL)，加1 mL 200 μM的DPPH乙醇溶液，加80%乙醇2 mL，共計(jì)反應(yīng)體系為4 mL，搖勻，在暗處放置30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度A。同時(shí)測(cè)定1 mL DPPH與3 mL 80%乙醇混合液的吸光度A′。對(duì)照組為Vc。清除率按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.2.2 還原力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]方法，分別取各樣品待測(cè)液50，100，200，300，400 μL于具塞試管中，各自補(bǔ)充蒸餾水至1 mL，加入pH 6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合后置于50℃水浴中20 min，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，4 800 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.1%三氯化鐵2.5 mL，混勻，靜置10 min，在700 nm處測(cè)定吸光度，用蒸餾水調(diào)零。對(duì)照組為Vc。

1.3.2.3 總抗氧化力測(cè)定

按文獻(xiàn)[10]采用磷鉬酸鹽法測(cè)定總抗氧化力，精密稱取磷酸鈉1.065 g，鉬酸銨0.494 g，濃硫酸3.28 mL，定容于100 mL，得混合液。取樣品500 μg/mL，加3 mL混合液，95 ℃水浴90 min，在695 nm處測(cè)吸光度。對(duì)照組為Vc。清除率按公式(2)計(jì)算：

(2)

1.3.3 抑菌活性測(cè)定

參照紙片擴(kuò)散法[11]，金黃色葡萄球菌(ATCC 12600，G+),綠膿桿菌(ATCC 10145，G-),大腸桿菌(ATCC 11775，G-)和克雷伯氏肺炎菌(ATCC 13883，G-)于4 ℃在熔融Mueller-Hinton營(yíng)養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)。10 μL樣品(20 mg/mL)滴加到紙片，新霉素(neomycin，500 μg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照藥，于37 ℃培養(yǎng)18 h后測(cè)定抑菌圈。

1.3.4 總黃酮的含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.012X-0.002 2，R2=0.999 7，線性范圍為8～40 μg/mL。

準(zhǔn)確稱量25 mg樣品，定容至25 mL容量瓶中。采用Al(NO)3-NaNO2比色法測(cè)定各提取部位及藥材80%乙醇提取浸膏的總黃酮含量，以蘆丁計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 虎刺各部位的抗氧化能力

2.1.1 各部位清除DPPH自由基活性

虎刺80%乙醇提取物(1)與石油醚部位(2)、二氯甲烷部位(3)、乙酸乙酯部位(4)及水溶性部位(5)清除DPPH自由基(DPPH·)能力有較大差異，結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 虎刺提取物及各部位清除DPPH·活性及總黃酮含量

由表1可知，乙酸乙酯部位(4)清除DPPH自由基活性較強(qiáng)，IC50為187.3 μg/mL。二氯甲烷部位(3)和水部位(5)對(duì)DPPH自由基清除率較弱，石油醚部位(2)清除DPPH自由基活性較強(qiáng)最弱，IC50> 800 μg/mL。

2.1.2 虎刺各部位的還原力

研究證實(shí)還原力與物質(zhì)的抗氧化活性是密切相關(guān)的，還原力高的抗氧化劑可以提供電子使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的分子而失去活性，減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)過(guò)程中的中間氧化物。圖1表明，虎刺各部位中乙酸乙酯部位(4)還原力最強(qiáng)，各樣品的抗氧化能力強(qiáng)弱順序?yàn)橐宜嵋阴ゲ课?水溶性部位>二氯甲烷部位>80%乙醇提取物>石油醚部位，但各部位的還原力遠(yuǎn)弱于Vc。

Vc的濃度是0，25，50，100，200，300 μg/mL

2.1.3 虎刺各部位的總抗氧化力

采用磷鉬酸鹽法測(cè)定總抗氧化性，吸光度越大則說(shuō)明其還原能力越強(qiáng)，抗氧化性也越強(qiáng)[10]。圖2表明，乙酸乙酯部位的還原能力最強(qiáng)，石油醚部位(2)和水溶性部位(5)的還原能力最弱，1 mg/mL濃度下吸光度A分別為0.3和0.4。各樣品的總抗氧化能力強(qiáng)弱順序?yàn)樗苄圆课?二氯甲烷部位>乙酸乙酯部位≈80%乙醇提取物>石油醚部位。

Vc的濃度是0，25，50，100，200，300 μg/mL

2.2 虎刺各部位抑菌實(shí)驗(yàn)

表2數(shù)據(jù)表明，虎刺二氯甲烷部位(3)、石油醚部位(2)和乙酸乙酯部位(4)具有一定的抑菌活性，其中二氯甲烷部位(3)對(duì)肺炎菌(ATCC 13883)的抑菌率最強(qiáng)，抑菌圈直徑為1.1 cm，水溶性部位(5)和80%乙醇提取物(1)的抑菌較弱。各樣品對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌表現(xiàn)出一定程度的敏感性。最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二氯甲烷部位(3)和乙酸乙酯部位(4)最小抑菌濃度為1.0 mg/mL左右(其它樣品的最小抑菌濃度數(shù)據(jù)未列出)。

表2 虎刺80%乙醇提取物及各部位的抗菌活性

2.3 各部位的總黃酮含量

表1說(shuō)明，虎刺80%乙醇提取物(1)與石油醚部位(2)、二氯甲烷部位(3)、乙酸乙酯部位(4)及水溶性部位(5)的總黃酮含量存在較大差異，其中二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位的總黃酮含量較高，分別為38.96 mg/g和35.04 mg/g，而水溶性部位和石油醚部位中總黃酮含量較低，僅為7.52 mg/g和3.29 mg。

乙酸乙酯部位和二氯甲烷部位含有豐富的總黃酮，表現(xiàn)出良好的除DPPH自由基能力和還原力，石油醚部位的總黃酮含量較低，3種抗氧化模型中均表現(xiàn)出微弱的抗氧化活性。但水溶性部位的黃酮含量雖然低，但在總抗氧化力和還原力模型中均表現(xiàn)良好的抗氧化活性，也具有一定的清除DPPH自由基能力。表明虎刺中的黃酮類化合物可能是其發(fā)揮抗氧化作用重要但非唯一的活性物質(zhì)，尤其是水溶性部位，可能含有非黃酮類的抗氧化物質(zhì)。結(jié)合表2，含總黃酮較多的二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位表現(xiàn)出一定的抑菌活性，而黃酮含量較低的石油醚部位也表現(xiàn)出一定程度的抑菌活性，可見(jiàn)總黃酮不是抗菌的主要活性物質(zhì)。虎刺的抑菌活性可能與蒽醌類化合物有關(guān)。

3 結(jié) 論

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)虎刺的研究較少，化學(xué)成分研究主要涉及蒽醌類化合物。對(duì)于其藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)研究還不夠深入，關(guān)于該藥材中黃酮類化合物的研究也是以預(yù)實(shí)驗(yàn)和含量測(cè)定居多。本文中考察虎刺的80%乙醇提取物和四個(gè)部位在DPPH自由基、還原力和總抗氧化力模型中的抗氧化能力和抑菌活性，以及和總黃酮含量之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)虎刺總黃酮可能是其發(fā)揮抗氧化作用的活性物質(zhì)。鑒于黃酮類成分在抗氧化、在抗炎等方面的生物活性，因此，虎刺中黃酮類化合物可能是該藥材廣泛藥理活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。深入研究虎刺中包括黃酮在內(nèi)的化學(xué)成分及其藥理活性，對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)虎刺這種常用的民族藥具有重要意義。

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